Orta Ölçekli Hazırlanışı<em> Drosophila</em> Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri
Summary
Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).
Abstract
Protein-protein etkileşimlerinin analizi (PPI'ler) hücre sinyalleri, organizma gelişimi ve hastalık gibi biyolojik süreçleri ve mekanizmaları incelemek için vazgeçilmez bir yaklaşım haline geldi. Etkileşim ağlarının en doğal ve yansız görüntüsünü elde etmek için genellikle in vivo materyal kullanılarak PPI bilgisini elde etmek istenir. Meyve sinekleri Drosophila melanogaster , PPI'ları in vivo olarak incelemek için mükemmel bir platformdur ve kendisini biyokimyasal deneyler için materyali izole etmek için doğrudan yaklaşımlara borç verir. Özellikle, meyve sineği embriyoları, hayvanları bu gelişim aşamasında toplama kolaylığı ve proteinlerin çoğunluğunun embriyogenezde eksprese edilmesi nedeniyle PPI'ları incelemek için uygun bir doku türü temsil eder ve böylece çoğu PPI'yı ortaya çıkaracak uygun bir ortam sağlar. Burada orta büyüklükte (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması için bir protokol sunmaktayız ki bu geniş bir aralık için ideal bir miktardırAfinite saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS) ile PPI'lerin analizi de dahil olmak üzere proteomik uygulamalar. Herhangi bir laboratuarda kolaylıkla ve ucuza kurulabilen embriyo koleksiyonları için 1 L ve 5 L kafesler için tasarımlarımızı açıklıyoruz. Ayrıca, AP-MS gibi aşağı akışlı uygulamalarda doğrudan kullanılabilen lizat üretmek için embriyo toplama ve protein ekstraksiyonu için genel bir protokol de sunuyoruz. Hedefimiz, tüm araştırmacılar için PPI analizlerini in vivo gerçekleştirmek için erişilebilir bir araç sağlamaktır.
Introduction
Genetik ekranlar ve daha yakın zamanda genomik yaklaşımlar biyolojik fonksiyonların incelenmesinde devrim yarattı. Bununla birlikte, önemli hücresel bilgiler, proteinlerde ve etkileşen ortakların topluluğunda kodlanır. Geleneksel genetik modifikatör ekranlar hız sınırlayıcı yol bileşenlerini belirleyebilir ve dolaylı etkileşimleri geri kazanabilirken, proteomik yaklaşımların gücü, ilgilenilen proteinlerin tam derhal etkileşim ağı tanımlama yeteneğinde yatar. Proteomik biyolojik sistemleri incelemek için dolayısıyla değerli ortogonal bir yöntemdir ve genomik, transkriptomikler ve geleneksel genetik ekranları tamamlar. Afinite saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS), protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) kendi doğal ortamlarındaki hücreler ve dokularda 1 , 2 çalışmak için güçlü bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır. Bu yöntem, spesifik gelişimde doğrudan veya dolaylı etkileşimlerin tanımlanmasına izin verir.Çeşitli aşamalardaki çeşitli PPI'leri tanımlamak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır (referans 1'de gözden geçirilmiştir). ÜFE çalışmalarının tartışılmaz bir başarıya rağmen, çoğu ilginç "yem" proteinlerinin aşırı eksprese edildiği kültür hücrelerinde gerçekleştirildi. Hücre kültüründe ÜFE'nin incelenmesi ile ilgili iki konu vardır: Birincisi, belirli bir hücre hattı, belirli proteinlerin ekspresyon eksikliği nedeniyle etkileşimleri tam olarak tamamlayamayabilir. İkincisi, bu tür analizlerde genellikle yüksek aşırı ifade, protein hatalı katlama veya sahte pozitif etkileşimlerin belirlenmesi gibi artefaktlara yol açabilir.
Bu sınırlamaların her ikisi de PPI'ları in vivo olarak analiz ederek üstesinden gelinebilir. Bu deneylerde sınırlayıcı bir adım, protein komplekslerinin saflaştırılması için başlangıç materyalinin bulunmasıdır. Drosophila melanogaster uzun zamandır fonksiyonel analize yönelik bir model olarak kullanılmıştırSis ve son zamanlarda in vivo PPI'ları incelemek için mükemmel bir sistem olduğu da gösterildi. Drosophila embriyogenezi, PPI'ları incelemek için özellikle cazip bir doku türünü temsil eder, çünkü embriyolar büyük miktarlarda kolayca toplanabilir ve ayrıca çoğu gen (>% 88) embriyogenesis boyunca eksprese edilir, bu nedenle alakalı algılama için zengin bir in vivo ortam sağlar ÜFE 3 .
Geleneksel olarak, sineklerdeki biyokimyasal çalışmalar, işlevsel transkripsiyonel lizatları 4 , 5'in saflaştırılması için gerekli olanlar gibi çok büyük ölçekli embriyo koleksiyonlarını (100-150 g) kullandı. Drosophila'daki önceki AP-MS çalışmalarında tandem afinite saflaştırması (TAP) gibi iki aşamalı bir saflaştırma yaklaşımına dayanan ve her adımda ilişkili malzeme kaybıyla 6 büyük miktarda embriyoya ihtiyaç duyulmuştur (5-10 g). Geniş amounBaşlangıçtaki materyalin ts'ı, (ticari olarak satın alındığında) hem pahalı, hem de 7 , 8 , 9'un bakım ve temizlenmesi için zaman alıcı olan büyük popülasyon kafeslerinde embriyo koleksiyonlarının kurulmasını gerektiriyordu.
Tek aşamalı afiniteli saflaştırma yaklaşımlarının geliştirilmesindeki son gelişmelerin yanı sıra, kütle spektrometrelerinin artan duyarlılığı, gerekli miktardaki başlangıç maddesini büyüklük sırasıyla azaltmıştır. Streptavidin-bağlayıcı peptit (SBP) veya yeşil floresan protein (GFP) gibi etiketleri kullanarak ve 1 g'dan daha az embriyondan başlayarak, yem proteininin miktarlarını ve tanımlama için yeterli olacak şekilde etkileşen bileşenleri izole etmek mümkündür. Kütle spektrometresi 10 , 11 .
Burada sunulan protokolün amacı, araştırmacılara aşırı derecede yardımcı olmaktır.Bana in vivo PPI'ların biyokimyasal analizine algılanan bir engel. Bu amaçla, orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarını toplamak için basit ve ucuz bir prosedürü takiben AP-MS veya başka yaklaşımlarla daha sonraki analizler için uygun tam hücre proteini özütlerinin bir aşamalı hazırlanması izlenmektedir . Metodumuz, herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca üretilebilen, özel olarak hazırlanmış 1-L veya 5-L popülasyon kafeslerinin kullanımına dayanır. Ayrıca burada sunulan ekstraksiyon koşulları hem kültürlenmiş hücreler hem de in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17'de yapılan birçok çalışmada doğrulanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol Drosophila popülasyon kafeslerini orta ölçekte kurmak ve embriyolardan tam hücreli protein ekstraktı yapmak için basit ve genel bir prosedürdür. Elde edilen ekstraktlar, afinite reçineleri üzerindeki protein komplekslerinin saflaştırılması gibi çeşitli aşağı akım uygulamaları içinde kullanılabilir. Buz üzerinde ekstraksiyon aşamalarını gerçekleştirmek ve protein bozunumunu en aza indirmek için güçlü proteaz inhibisyonu kullanmak kritik önem taş…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Veressa laboratuvarının üyelerine, el yazması üzerine faydalı yorumlar ve protokol iyileştirmeleri için öneriler yaptıkları için teşekkür ederler. AV, NIH hibeleri GM105813 ve NS096402 tarafından desteklendi. LY, Massachusetts Üniversitesi Boston Sanofi Genzyme Doktora Bursu tarafından desteklendi.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
Referências
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genética. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genética. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O’Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
