Sistema di integrazione bidirezionale retrovirale Metodo PCR e flusso di lavoro analitico dei dati quantitativi
Summary
Questo manoscritto descrive la procedura sperimentale e l'analisi del software per un test di sito di integrazione bidirezionale che può contemporaneamente analizzare il DNA di giunzione vettoriale-host a monte ea valle. I prodotti bidirezionali di PCR possono essere usati per qualsiasi piattaforma di sequencing a valle. I dati risultanti sono utili per un confronto quantitativo e ad alto rendimento dei target integrati del DNA.
Abstract
I test di sito di integrazione (IS) sono una componente fondamentale dello studio dei siti di integrazione retrovirale e del loro significato biologico. Negli ultimi studi di terapia genica retrovirale, i test di IS, in combinazione con sequenziamento di nuova generazione, sono stati utilizzati come strumento di monitoraggio delle cellule per caratterizzare le popolazioni di cellule staminali clonali che condividono la stessa IS. Per il confronto preciso dei cloni di cellule staminali ripopolari all'interno e tra diversi campioni, la sensibilità di rilevazione, la riproducibilità dei dati e la capacità di trasmissione elevata del dosaggio sono tra le qualità di dosaggio più importanti. Questo lavoro fornisce un flusso di lavoro dettagliato per il protocollo e l'analisi dei dati per l'analisi bidirezionale dell'IS. Il saggio bidirezionale può simultaneamente sequenziare giunzioni sia a monte che a valle del vettore-host. Rispetto agli approcci convenzionali sequenziali unidirezionali, l'approccio bidirezionale migliora notevolmente i tassi di rilevazione di IS e la caratterizzazione degli eventi di integrazione a entrambe le estremità di tEgli mira al DNA. L'analisi dei dati descritta qui accuratamente identifica e enumera le sequenze identiche di IS attraverso più fasi di confronto che mappono le sequenze di IS sul genoma di riferimento e determinano gli errori di sequenza. Utilizzando una procedura di dosaggio ottimizzata, abbiamo recentemente pubblicato gli schemi di repopulazione dettagliati di migliaia di cloni di cellule staminali ematopoietiche (HSC) dopo il trapianto in macaques rhesus, dimostrando per la prima volta il momento preciso del ripopolamento HSC e l'eterogeneità funzionale degli HSC nel Sistema primato. Il seguente protocollo descrive la procedura sperimentale dettagliata e il flusso di lavoro di analisi dei dati che identifica con precisione e quantifica le sequenze identiche di IS.
Introduction
Retrovirus inserire il loro DNA genomico nel genoma ospite in vari siti. Questa proprietà unica, che può contribuire allo sviluppo di tumori e altre forme di patogenesi virale, ha il vantaggio ironico di rendere tali virus altamente suscettibili all'ingegneria cellulare per la terapia genica e la ricerca di base della biologia. Il sito di integrazione virale (IS) – l'ubicazione sul genoma ospite in cui è integrato un DNA straniero (virus) – ha importanti implicazioni per il destino sia dei virus integrati che delle cellule ospitanti. I test di IS sono stati utilizzati in varie impostazioni di ricerca biologiche e cliniche per studiare la selezione e la patogenesi dei siti di integrazione retrovirale, lo sviluppo del cancro, la biologia delle cellule staminali e la biologia dello sviluppo 1 , 2 , 3 , 4 . Sono tra le minore sensibilità di rilevazione, la scarsa riproducibilità dei dati e la frequente contaminazione incrociataI fattori chiave che limitano le applicazioni dei test IS a studi attuali e pianificati.
Sono state sviluppate molte tecnologie di analisi IS. I più ampiamente utilizzati sono i test del sito di integrazione a base di enzimi di restrizione, tra cui la reazione a catena polimerasi (PCR) 5 , PCR inversa PCR 6 e LAM (PCR 7 ) mediata da amplificazione lineare (LAM). L'uso di enzimi di restrizione specifici del sito, tuttavia, genera una polarizzazione durante il recupero dell'IS, consentendo solo un sottoinsieme di integromi (un DNA straniero integrato nel genoma ospite) nelle vicinanze del sito di restrizione da recuperare 4 . Sono state introdotte anche tecnologie di analisi che valutano in modo più ampio il vettore IS negli ultimi anni. Questi test impiegano varie strategie, tra cui Mu transposone mediato PCR 8 , non restrittivo (nr) -LAM PCR 9 , tipo II restriction enzymLa digestione 10 , la tranciatura meccanica 11 e il PCR a base di esame casuale (PCR re-free) 12 , per frammentare i DNA genomici e amplificare l'IS. Le tecnologie correnti hanno diversi livelli di sensibilità di rilevazione, copertura del genoma, specificità dell'obiettivo, capacità di trasmissione elevata, complessità delle procedure di analisi e pregiudizi nel rilevare le frequenze relative dei siti target. Dato le varie qualità dei test esistenti e la varietà di scopi per cui possono essere utilizzati, l'approccio ottimale del dosaggio deve essere attentamente selezionato.
Questo lavoro fornisce procedure dettagliate sperimentali e un flusso di lavoro di analisi dei dati computazionali per un test bidirezionale che migliora notevolmente i tassi di rilevazione e la precisione di quantificazione della sequenza analizzando simultaneamente l'IS a monte ea valle del DNA target integrato (si veda la figura 1 per una visione schematica delle procedure di analisi ). Questo approccio fornisce ancheI mezzi per caratterizzare il processo di integrazione retrovirale (ad esempio, la fedeltà della duplicazione del sito di destinazione e delle variazioni nelle sequenze genomiche di inserzioni a monte ea valle). Altri metodi bidirezionali sono stati usati principalmente per la clonazione e il sequenziamento di entrambe le estremità del DNA bersaglio 11 , 13 , 14 . Questo test è ampiamente ottimizzato per la quantificazione ad alta percentuale e riproducibile di cloni marcati da vettori, utilizzando il metodo LM-PCR consolidato e mappatura di analisi computazionale e per la quantificazione delle giunzioni a monte ea valle. L'analisi bidirezionale con l'enzima TaqαI si è dimostrata utile per la quantificazione clonale ad alta percentuale in studi preclinici per la terapia genica delle cellule staminali 2 , 15 . Questo articolo descrive un metodo modificato che utilizza una taglierina più frequente (RsaI / CviQI – motivo: GTAC) che raddoppia tHa probabilità di rilevare gli integri rispetto ad un test basato su TaqαI . Sono descritte procedure dettagliate di analisi sperimentale e di dati che utilizzano enzimi motivi GTAC per lentivirali (NL4.3 e suoi derivati) e vectori gamma-retrovirali (vettori pMX). Gli oligonucleotidi usati nel saggio sono elencati nella tabella 1 . Uno script di programmazione interno per l'analisi sequenza IS è fornito nel documento supplementare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio bidirezionale consente l'analisi simultanea sia delle sequenze di giunzione del DNA vettori-host a monte (a sinistra) che a valle (destra) ed è utile in una serie di terapie geniche, cellule staminali e applicazioni di ricerca del cancro. L'uso di enzimi GTAC-motif (RsaI e CviQI) e l'approccio PCR bidirezionale migliorano significativamente le possibilità di individuazione di un integro (o di una popolazione clonale) rispetto ai precedenti dosaggi 2,15 , basati su enzimi a motivo TCG…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I finanziamenti sono stati forniti dai finanziamenti nazionali dell'Istituto di assistenza sanitaria R00-HL116234, U19 AI117941 e R56 HL126544; La National Science Foundation Grant DMS-1516675; La Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); E il programma di iniziativa KRIBB.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
Referências
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