Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule
Summary
Diversi metodi per manipolare architettura tridimensionale in idrogel a base di proteine vengono valutate qui rispetto alla proprietà del materiale. Le reti di macroporosa sono funzionalizzate con un peptide di cella-adesivo, e loro fattibilità in coltura cellulare viene valutata utilizzando due linee cellulari di modello diverso.
Abstract
Idrogeli sono riconosciuti come materiali promettenti per applicazioni della coltura delle cellule dovuto la loro capacità di fornire ambienti di cellule altamente idratata. Il campo dei modelli 3D è in aumento per la somiglianza potenziale di tali materiali alla matrice extracellulare naturale. Idrogel a base di proteine sono particolarmente promettenti, perché possono facilmente essere funzionalizzati e può raggiungere strutture definite con proprietà fisico-chimiche regolabile. Tuttavia, la produzione di modelli 3D di macroporoso per applicazioni della coltura delle cellule usando materiali naturali è spesso limitata dalla loro proprietà meccaniche più deboli rispetto a quelle dei materiali sintetici. Qui, sono stati valutati diversi metodi per produrre macroporosa albumina di siero bovino (BSA)-sistemi basati su idrogel, con dimensioni dei pori regolabile nel range di 10 a 70 µm nel raggio. Inoltre, è stato stabilito un metodo per generare canali in questo materiale di base di proteine che sono lungo diverse centinaio di micron. I diversi metodi per produrre i pori, come pure l’influenza della dimensione dei pori sulla proprietà del materiale come gonfiore rapporto, pH, stabilità di temperatura e comportamento di degradazione enzimatica, sono stati analizzati. Dimensioni dei pori sono stati studiati nello stato nativo, gonfio di idrogeli mediante microscopia a scansione laser confocale. La fattibilità per applicazioni della coltura delle cellule è stata valutata usando una cella-adesivo RGD peptide modifica del sistema della proteina e di due linee cellulari modello: cellule di cancro al seno umane (A549) e adenocarcinomic alveolare basale epiteliale cellule umane (MCF7).
Introduction
Idrogeli sono materiali che formano reti 3D insolubile in grado di legare grandi quantità di acqua. Tali materiali in grado di fornire ottime condizioni ambientali per le cellule viventi. Attualmente, vi è crescente interesse nella generazione di strutture tridimensionali idrogel e nello sviluppo di processi per adattare i loro proprietà chimiche e fisiche. Una volta che questo è realizzato, un modello per la crescita delle cellule e la manipolazione del comportamento cellulare può essere generato1,2,3,4. Queste strutture 3D non solo creano un ambiente più naturale e realistico che approcci convenzionali bidimensionali, ma loro anche rivelare nuove possibilità per la crescita delle cellule staminali o tumore modelli5. Diversi materiali possiedono una gamma di caratteristiche che dipendono principalmente la dimensione dei pori del gel6. I pori giocano un ruolo cruciale nelle applicazioni della coltura delle cellule, l’ingegneria dei tessuti e la crescita delle cellule staminali diretta. Ad esempio, ossigeno e sostanze nutritive si diffondono attraverso la matrice, e gli importi adeguati devono essere in grado di raggiungere le cellule7. D’altra parte, metaboliti nocivi devono essere rimossi nel minor tempo possibile, e spazio sufficiente per la crescita delle cellule deve essere disponibile7. Di conseguenza, le proprietà del materiale e così la dimensione dei pori, gravemente influenzano le applicazioni potenziali benefici e possibili della matrice. Processi di crescita delle cellule differenti dipendendo le proprietà del materiale, possono verificarsi nella coltura cellulare 3D, compresa la formazione di strutture di un neurone; la crescita e la differenziazione delle cellule della pelle o dell’osso; e la crescita diretta delle linee speciali sulle cellule staminali, come gli epatociti o fibroblasti2,3,8,9,10,11. Un altro punto cruciale che influenzano l’eventuale applicazione di un materiale è la sua stabilità verso stimoli esterni12. Ad esempio, l’idrogel deve mantenere la sua integrità meccanica in terreni di coltura delle cellule o il corpo umano.
Negli ultimi anni, ricerca sul cellulare 3D cultura idrogeli intensificati, e molti studi sono stati effettuati per risolvere le architetture 3D dei sistemi13. Idrogeli composti di componenti chimicamente sintetizzati sono più comunemente studiati perché possono essere facilmente sintetizzati e modificati chimicamente ed esibiscono alta stabilità (Vedi Zhu et al., 2011 per una recensione)5. Tuttavia, le proteine hanno molte proprietà benefiche: come cosiddetto “polimeri di precisione”, sono biocompatibili; hanno una lunghezza definita; sono relativamente facili da modificare; e hanno un gran numero di destinazione siti14,15. A questo proposito, le strutture altamente specifiche, innovative possono essere generate per applicazione in molti campi. In questo studio, un idrogel a base di proteine16 è stato utilizzato per dimostrare la capacità dei metodi consolidati per influenzare l’architettura 3D del materiale. Inoltre, la capacità di e l’applicabilità al poro generazione inoltre è stata studiata.
Diverse tecniche sono disponibili per modificare le strutture 3D, inclusi sia metodi semplici e sofisticate, altamente specializzate tecniche provenienti da diversi campi della scienza dei materiali. Una tecnica diffusa è l’uso di elettrofilatura per generare strutture ben definite17. Carica le fibre vengono estratti da una soluzione da un campo elettrico e quindi solidificano sopra l’esposizione all’ossigeno. In questo modo, possono essere prodotte fibre nella gamma di diversi nanometri fino a parecchi micron. Ulteriori tecniche per ottimizzare le dimensioni, la struttura e la distribuzione dei pori all’interno della matrice sono litografia soft, fotolitografia, focalizzazione idrodinamica, electro-spruzzatura e bio-stampa18,19,20. Un notevole svantaggio di queste tecniche è la loro dipendenza specifiche, costose apparecchiature e prodotti chimici speciali o materiali. Inoltre, l’esperienza con queste tecniche spesso non è direttamente trasferibile ai materiali a base di proteine, e molte delle sostanze chimiche e metodi non sono cellulare compatibile.
D’altra parte, molte tecniche non fare affidamento su attrezzature speciali, che li rende più facile e più conveniente di applicare e di riprodurre. Un metodo diffuso per la manipolazione di struttura è colata solvente21,22,23. Le particelle vengono aggiunti prima della reazione di polimerizzazione e sono distribuite in modo omogeneo per saturare la soluzione. Dopo la polimerizzazione, un cambiamento delle circostanze, ad esempio una diluizione o un cambiamento di pH, conduce alla solvatazione delle particelle, mentre i pori rimangono all’interno del materiale. I prodotti chimici usati in queste tecniche, come sale, zucchero, paraffina, gelatina e gesso, sono a buon mercato e facilmente reperibili. Nella liofilizzazione, idrogeli gonfiati sono congelati. La successiva sublimazione delle fasi liquidi sotto vuoto è quindi eseguito23,24,25. Sublimazione di acqua dalla rete è abbastanza delicato per mantenere le strutture 3D specifiche del materiale. Nel gas di schiumatura, una soluzione è in streaming con un gas mentre la polimerizzazione avviene, lasciando i pori all’interno del gel di21. La dimensione e la distribuzione dei pori può essere regolate a seconda del flusso di gas.
Per formare la proteina idrogel, BSA viene fatto reagire con cloruro di tetrachis (idrossimetil) fosfonio (THPC) in una reazione di Mannich-tipo per consentire la formazione di legami covalenti tra le ammine primarie e i gruppi idrossi della molecola del linker quattro braccia26. Eventuali intermedi reattivi nocivi vengono rimossi mediante lavaggio eccessivo del materiale dopo la reazione si verifica.
Questo studio dimostra la possibilità di trattare un materiale a base di BSA con diverse tecniche per manipolare e adattare la dimensione dei pori. Ciascuna delle tecniche può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio in tutto il mondo, come nessuna attrezzatura speciale è necessaria. Inoltre, diversi parametri, come rapporto di gonfiore, degradabilità enzimatica, stabilità del pH e la sensibilità di temperatura, esaminati e confrontati tra loro, soprattutto rispettano all’influenza delle diverse tecniche sulla generazione di architetture 3D. Infine, i materiali sono stati funzionalizzati con peptidi di cella-adesivo per indagare la possibile applicazione dei materiali in coltura cellulare. Due linee di cellule di diverso modello sono stati utilizzati: A549 e MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Stiftung di Baden-Württemberg per il loro sostegno finanziario nel quadro “Sintesi di materiali bioinalati” (biostuoie-14).
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
Referências
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
