Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

Resumo

Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.

Resumo

A camada endotelial é essencial para manter a homeostase do corpo, controlando muitas funções diferentes. Regulação da resposta inflamatória pela camada endotelial é crucial para lutar eficientemente contra entradas prejudiciais e ajuda na recuperação de áreas danificadas. Quando as células endoteliais são expostas a um ambiente inflamatório, tais como o componente exterior da membrana de bactérias Gram-negativas, lipopolissacarídeo (LPS), eles expressam solúveis citocinas pró-inflamatórias, como Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e acionar o ativação de leucócitos em circulação. Além disso, a expressão de moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na superfície endotelial permite a interação e a adesão de leucócitos ativados para a camada endotelial e eventualmente o extravasamento para o tecido inflamado. Nesse cenário, a função endotelial deve ser fortemente regulamentada porque ativação excessiva ou com defeito no recrutamento de leucócitos pode levar a desordens inflamatórias-relacionadas. Desde que muitos destes transtornos não têm um tratamento eficaz, novas estratégias com foco na camada vascular devem ser investigadas. Propomos a ensaios abrangentes que são úteis para a busca de novos reguladores endoteliais que modificar a função dos leucócitos. Analisamos a ativação endotelial usando alvos específicos expressão envolvidos no recrutamento de leucócitos (por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) com várias técnicas, incluindo: (reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real RT-qPCR), western-blot, ensaios de aderência e citometria de fluxo. Essas abordagens determinar função endotelial no contexto inflamatório e são muito úteis para realizar ensaios de triagem para caracterizar o romance reguladores inflamatórios endoteliais que são potencialmente valiosos para a concepção de novas estratégias terapêuticas.

Introdução

A inflamação é uma resposta biológica benéfica contra agentes infecciosos, com o objectivo principal de eliminar o patógeno e reparar o tecido danificado. Sob certas condições, tais como infecções crônicas ou doenças auto-imunes, inflamação não resolve. Em vez disso, há uma reação anormal com a contínua infiltração de leucócitos, resultando em uma resposta imune prolongada que leva a danos nos tecidos, fibrose, perda de função e em geral, deficiência e em alguma morte de casos do paciente. Estes distúrbios humanos, catalogados como doenças inflamatórias, todos envolvem os vasos sanguíneos para o controle de extravasamento de leucócitos^1,

Protocolo

1. cultura de células endoteliais

1. cultura de tecido Tratado placas
   1. placas de cultura de tecido casaco 100 mm com gelatina de 2,5 mL de solução (autoclavados, 0,1% de gelatina em água destilada) por 30 min a 37 ° C; esse pode ser extrapolada para o formato exigido bem. Aspirar a solução de gelatina e deixe placas para secar ao ar livre do bairro de cultura de tecidos.
2. As condições de cultura de tecido
   1. cultivar as MLEC-04 células dentro de uma incubadora biológica (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO ₂). Crescem as células em mídia completa de Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: m....

Resultados

Avaliação da ativação de células endoteliais induzida por LPS por RT-qPCR

As soro fome MLEC-04 células foram estimuladas por 100 ng/mL de LPS para 6h, e a expressão de gene endotelial foi avaliada por meio de RT-qPCR, comparando a expressão de marcadores de ativação para a condição de repouso. Como mostrado na figura 1A, as células de LPS incubados MLEC-04 induziram a expressão de RNAm de moléculas de .......

Discussão

Este protocolo endotelial descreve uma tecnologia gradual que estabelece as bases para explorar novos mecanismos envolvidos na regulação da resposta inflamatória. Essas abordagens baseiam-se no estudo da atividade endotelial estimulado por LPS e avaliar os passos críticos envolvidos no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória, especificamente: liberação de citocinas endotelial, adesão endotelial adesão de expressão e leucócitos moléculas para a camada vascular. Uma vez que os parâmetros endoteliais são .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gelatina		Sigma G9391
DMEM-F12	Lonza	BE12-719F
Soro bovino fetal	Sigma	A4503
Penicilina estreptomicina	Lonza	DE17-602E
Tripsina	Lonza	BE17-160E
EDTA	Sigma	ED2SS
LPS	Sigma	L2880
Trizol	Sigma	T9424	tampão de extração de RNA
Isopropanol	Sigma	33539
Etanol absoluto	Panreac	1.310.861.612
Pure H2O	Qiagen	1017979	RNAse livre
Agarose	Pronadisa	8020
Mancha para géis de agarose	Invitrogen	s33102
SuperScript III First-Strand Synth	Invitrogen	18080051	Reagentes para RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385610	Coloração fluorescente para qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-Well	Applied Biosystems	4346906	Placas para qPCR
U-bottom 96 placas de poços	Falcon	353072
Tubos de citometria	Falcon	352054
TX100	Panreac	212314	Surfactante não iônico
Tris-HCl	Panreac	1.319.401.211
Cloreto de sódio	Merck	1.064.041.000
Pirofosfato de sódio	Sigma	221368
Fluoreto de sódio	Sigma	S7920
Orthovanadato de sódio	sigma	13721-39-6
Inibidor de protease coquetel	sigma	P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225	Reagentes para ensaio de ácido bicinchonínico
β-mercaptoetanol	merck	805,740
PVDF Membrana de Transferência, 0.45 µ m	Thermo Scientific	88518
Tween-20	Panreac	1,623,121,611	Polissorbato 20
PBS	Lonza	BE17-515Q
ECL	Millipore	WBKLS0500
Fibronectina	Sigma	F1141
Laminina	Sigma	L2020
Colágeno tipo I	Sigma	c8919
Ácido acético	Panreac	1.310.081.611
Azul de tripano	Sigma	T8154
Paraformaldeído	Sigma	P6148
Metanol	Panreac	1.310.911.612
Cristal violeta	Sigma	HT90132
Citrato de sódio	Sigma	C7254
Etanol 96%	Panreac	1.410.851.212
CFSE	Sigma	21888
RPMI	Lonza	BE12-115F
SDS	Bio-Rad	161-0418
Infinite M200	Tecan	M200	Leitor de microplacas multimodo
Gel Doc 2000	Bio-Rad	2000	Sistema de documentação de gel
StepOnePlus	Applied Biosystems	StepOnePlus	qPCR system
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	Analyzer 10	Equipamento de citometria
ChemiDoc MP	Bio-Rad	MP	Sistema de detecção de quimioluminescência
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
Anticorpos
PECAM-1	BD Biosciences	553370	Use a 10 µ g/mL
ICAM-2	Biolegend	1054602	Uso a 10 µ g / mL
E-selectina	BD Biosciences	553749	Uso a 10 µ g/mL
VCAM-1	BD Biosciences	553330	Use a 10 µ g/mL
ICAM-1	Becton Dickinson	553250	Use a 10 µ g/mL
anti-rato IgG-FITC	Jackson Immuno Research	112-095-006	Use em 10 µ g/mL
anti hamster armênio-FITC	Jackson Immuno Research	127-095-160	Use em 10 µ g/mL
Controle de isotyope IgG de rato	Invitrogen	10700	Use a 10 µ g/mL
de controle de isotipo IgG de hamster armênio	Invitrogen	PA5-33220	Use a 10 µ g/mL
P-Iκ β-&alfa;	Sinalização Celular	2859	Use em 10 µ g/mL
β-Actin	Sigma	A5441	Use a 10 µ g/mL
P-ERK	Cell Signaling	9101	Use a 10 µ g/mL
anti-camundongo HRP	GE Healthcare	LNXA931/AE	Uso a 1:10.000
anti-coelho HRP	GE Healthcare	LNA934V/AG	Uso a 1:10.000
anti-rato HRP	Santa Cruz	Sc-3823	Uso a 1:10.000