В пробирке Полимеризация F-актина на ранних Endosomes
Summary
Ранние endosome функции зависят от F-актина полимеризации. Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются биохимических и генетических манипуляции.
Abstract
Многие ранние endosome функции, особенно грузовых белка сортировки и мембраны деформации, зависит патчи короткие F-миозина нитей, тому на мембраны от англ. Мы создали на основе микроскопии в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются генетических и биохимических манипуляции. Размещения в сахарозы градиенты из клеток, выражая раннего от англ белка GFP-RAB5 готовятся дроби от англ. Цитозольной фракции готовятся из отдельных партий клеток. От англ и цитозольной фракции могут храниться в жидком азоте, при необходимости. В assay от англ и цитозольной фракции являются смешанными, и смесь инкубировали при 37 ° C при соответствующих условиях (например, ионной силы, сокращение среды). В нужное время реакционную смесь является фиксированным, и F-актина раскрывается с Фаллоидин. Актин нуклеации и полимеризации затем анализируются микроскопии флуоресцирования. Здесь мы сообщаем, что этот assay может использоваться для изучения роли факторов, которые участвуют в актина нуклеации на мембрану, или последующих удлинение, ветвление или сшивки F-миозина нитей.
Introduction
В высших эукариотических клеток белков и липидов интернализации в начале endosomes, где происходит сортировка. Некоторые белки и липиды, которые суждено быть переработке, включены в трубчатых регионов раннего endosomes и затем транспортируется к плазматической мембраны или транс Гольджи сеть (TGN)1,2. Напротив другие белки и липиды выборочно упаковываются в регионах раннего endosomes, которые экспонат multivesicular внешний вид. Эти регионы расширить и на отрыв от ранних мембран от англ, в конечном итоге Зрелые в свободной от англ перевозчик везикулы или multivesicular органов (ECV/MVBs), которые отвечают за грузового транспорта на конце endosomes1, 2.
Актина играет решающую роль в процессе реконструкции мембраны, связанные с endosome биогенеза сортировки потенциала от англ. Сортировка по утилизации пути к плазматической мембраны или TGN белка зависит от связанных белков и retromer комплекс. Этот механизм сортировки, как представляется, быть связан к формированию рециркуляции трубочки через взаимодействия retromer комплекс, с WASP и шрам гомолог (ВСГ) сложной и разветвленной актина3,4,5 . В отличие от молекул предназначенных для деградации, особенно активации сигнализации рецепторов, в внутрипросветная везикулы (ILVs), сортируются от англ, сортировка комплексы для транспорта (ESCRT)2,6, 7. Хотя возможная роль актина в процессе сортировки зависит от ESCRT не известно, F-актина играет важную роль в биогенеза ECV/MVBs и транспорта за ранней endosomes. В частности мы обнаружили, что annexin A2 связывает холестерин обогащенный регионов ранних endosome и вместе с spire1, зарождается F-актина полимеризации. Формирование сети разветвленной актина, наблюдается на endosomes требует ветвления деятельность связанных с актина белка (ARP) 2/3 комплекс, а также moesin белка ERM и актин связывания белка cortactin8,9.
Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках. Ранее был использован этот assay расследовать роль annexin A2 в F-актина нуклеации и moesin и cortactin в формировании от англ актина сети8,9. Этот протокол в пробирке серии сложных реакций, которые происходят на endosomes в процессе полимеризации актина стать поддаются биохимических и молекулярных анализ последовательных шагов этого процесса, включая актина нуклеации, линейный полимеризация, ветвления и сшивки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Актин играет решающую роль в endosome мембраны динамика4,14. Мы ранее сообщали, что актина нуклеации и полимеризации происходит на начале endosomes, образуя небольшие F-актина патчи или сетей. Эти сети F-актина абсолютно необходимы для мембранный транспорт за преде?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержка была получена от швейцарского национального научного фонда; Швейцарская компания “Синергия” программы; Польско Швейцарский исследований программы (PSPB-094/2010); NCCR в химической биологии; и LipidX из швейцарской SystemsX.ch инициативы, оцениваются как Швейцарский Национальный научный фонд (с J. G.). О. м. была поддержана EMBO долгосрочных стипендий (ALTF-516-2012).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
Referências
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!. Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
