In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren
Summary
Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.
Abstract
Zirkadianen Rhythmus ist ein grundlegender physiologischer Prozess in allen Organismen vorhanden, der biologischen Prozesse von Genexpression Verhalten schlafen regelt. Bei Wirbeltieren ist ein molekularer Oszillator funktioniert in den suprachiasmatischen Kern (SCN; zentrale Herzschrittmacher) und einzelne Zellen bestehend aus den peripheren Geweben, zirkadianen Rhythmus gesteuert. Noch wichtiger ist die Störungen des zirkadianen Rhythmus durch die Einwirkung von Licht in der Nacht, Umweltstressfaktoren und/oder Giftstoffe mit erhöhten Risiko von chronischen Krankheiten und Alterung. Die Fähigkeit zur Identifizierung von Agenten, die zentralen und/oder peripheren biologischen Uhren stören können und -Agenten, die verhindern können oder zur Abmilderung der Auswirkungen von circadian Disruption, hat erhebliche Auswirkungen auf die Prävention von chronischen Krankheiten. Obwohl Nager-Modelle verwendet werden können, Belichtungszeiten und Agenten, die zu induzieren oder zu verhindern/mindern zirkadiane Störungen zu identifizieren, eine diese Experimente große Anzahl von Tieren. Auch in Vivo Studien erfordern erhebliche Ressourcen und Infrastruktur und benötigen Forscher eine ganze Nacht. So gibt es eine dringende Notwendigkeit für einen Zelltyp geeignete in-vitro- System zum Bildschirm für ökologische circadiane Disruptoren und Geschmacksverstärker in Zelltypen aus verschiedenen Organen und Krankheitszustände. Wir konstruierten einen Vektor, der Transkription von destabilisiert Luciferase in eukaryontischen Zellen unter der Kontrolle des menschlichen Periode 2 gen Veranstalters antreibt. Dieses Konstrukt circadiane Reporter war stabil transfizierten in menschlichen Mamma Epithelzellen und circadiane reagieren Reporter Zellen wurden ausgewählt, um die in-vitro- Biolumineszenz-Assay zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zu entwickeln und überprüfen den Assay. Wir bieten weitere Details für den Nachweis der Konzept-Experimenten demonstriert die Fähigkeit unsere in-vitro- Tests, die in Vivo Effekte verschiedener Chemikalien auf die zelluläre biologische Uhr rekapitulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass der Test an einer Vielzahl von Zelltypen für ökologische Disruptoren und chemopräventiven Enhancer zirkadiane Uhren auf den Bildschirm angepasst werden kann.
Introduction
Der circadiane Uhr regelt eine Vielzahl biologischer Prozesse von tagaktive Expression von Genen zu Verhalten in einem vorhersehbaren Rhythmus schlafen mit einer Periodizität von ca. 24 Std. epidemiologische Studien empfehlen, dass chronische Störungen des zirkadianen Rhythmus erhöht das Risiko von Brust- und Prostatakrebs in Schichtarbeiter, einschließlich Krankenschwestern und Flight Crews1,2,3. Diese Erkenntnisse sind von Nagetier Studien, die zeigen, dass die Exposition gegenüber konstantes Licht, Licht in der Nacht, oder leichte Zyklen, die Erhöhung der Jetlag Tumor-Inzidenz zu imitieren und beschleunigt Tumor Wachstum4,5bestätigt. Basierend auf Daten aus menschlichen und Nagetier Studien, der International Agency for Research on Cancer Schichtarbeit als eine wahrscheinliche menschliches Karzinogen (Typ 2A) in 20106eingestuft.
Zuvor, wir gezeigt, dass eine krebserregende Einzeldosis von Milch-Tumor spezifischen Karzinogen, N– Nitroso-N– Methylurea (NMU), gestört den zirkadianen Ausdruck der großen zirkadiane Gene (CGs) (z.B., Periode 2 , Per2) und mehrere circadiane gesteuert Gene (KVG), einschließlich der wichtigsten DNA-Schäden reagieren und reparieren (DDRR) Gene in der Ziel-Brustdrüse (aber nicht in der Leber). Darüber hinaus Zurücksetzen des zirkadianen Ausdrucks Per2 und Dislozieren Gene in die normale Richtung durch ein chemopräventiver Regime von diätetischen L-Methyl-Selenocystein (MSC) reduziert die Häufigkeit des Tumors um 63 %. Diese Erkenntnisse waren die ersten, die eine mechanische Verbindung zwischen zirkadianen Rhythmus, chemische Karzinogenese und Chemoprävention7,8. Forderungen an andere Umweltgifte gezeigt, circadiane gen Ausdruck in Vivo zu stören sind auch verbunden mit einem erhöhten Risiko von Umweltkrankheiten9,10. Das Verständnis der Mechanismen, die zirkadiane Störungen durch Umweltgifte und Pathogenese verbinden kann zu mechanistisch-basierte Ansätze zur Prävention von Krankheiten führen. Jedoch Studien zur Festlegung der Interaktionen zwischen den Aufnahmen und circadianen Rhythmus erfolgen in der Regel in-vivo. Eine typische in Vivo Experiment untersucht die Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus große Zahl von Tieren, erfordert, wie Steuern, Gewebe aus mindestens drei und drei exponierten Tiere gesammelt alle 3-4 Std. über einen Zeitraum von 24 oder 48 h. Entwicklung eines validierte in-vitro- System, das in Vivo Beobachtungen und Mechanismen rekapituliert würde daher nicht nur die Zahl der Tiere, aber auch dramatisch experimentelle Kosten zu senken und die Anforderung, die Forscher arbeiten kontinuierlich über einen Zeitraum von 24-48 h. Darüber hinaus könnte eine validierte in-Vitro -System verwendet werden, für Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen und/oder genetische Veränderung, die zirkadianen Rhythmus oder seine Reaktion auf ökologische Stressoren oder Giftstoffe beeinträchtigen. Deshalb die strategische Kombination von in Vitro und in Vivo Modelle und Experimente sind erforderlich, um verschiedene Einblicke mit unterschiedlichem Fokus zu erhalten.
Bei Säugetieren existieren circadiane Oszillatoren nicht nur in spezialisierten Neuronen des SCN, sondern auch in äußerster Randlage Zelltypen. Diese molekulare Taktgeber sind ähnlich denen in etablierten Fibroblasten-Zell-Linien und primäre Fibroblasten aus Embryonen oder ausgewachsene Tiere; Allerdings gibt es eine Notwendigkeit für Gewebe-spezifischen Zellmodellen11. Infolgedessen traditionelle Studien des Bewegungsapparates Aktivität in Vivo, SCN explants ex Vivound Zell-basierte in-vitro- Tests in verewigt Fibroblastenzellen sind weit verbreitet, Zelle-autonome circadiane Mängel zu studieren. Allerdings gibt es keine Hinweise darauf, dass eine in-vitro- Fibroblasten zellbasierte Assays circadiane Mechanismen Zusammenfassen kann und Antworten in Zellen von anderen peripheren Organe in Vivovorhanden. Verschiedene Zelltypen können unterschiedliche Muster der Genexpression, Xenobiotika Stoffwechsel und Dislozieren, und die Verbindungen zwischen Toxizität und circadiane Genexpression möglicherweise Zelltyp spezifische und/oder durch verschiedene physiologische Parameter moduliert. Darüber hinaus wurden circadiane Oszillatoren in Fibroblasten-basierten Systemen nicht vollständig bewertet für Reaktionen auf Umweltgifte, Stressoren und präventive Agenten, die Aufnahmen auf Mechanismen der Krankheitsentstehung und Prävention zu verbinden. So gibt es eine Notwendigkeit für facile, validierten Zelltyp-spezifische, in-vitro- Biolumineszenz-Assays, Organ spezifischen ökologischen circadiane Disruptoren zu studieren. Obwohl eine Vielzahl von zellulären Uhrenmodelle (z. B.in Leber, Keratinozyten, sowie Fettzellen und ein Osteosarkom-Zelllinie) haben worden in den letzten Jahren12,13,14, entwickelt 15, der hier beschriebenen Test ist das erste Handy Uhr Modell in Brust Epithelzellen und die erste Demonstration in Vivo Antworten auf ökologische Stressoren, Giftstoffe, Medikamente und chemopräventiven Agenten zu rekapitulieren.
Renilla-Luciferase (rLuc) und Firefly Luciferase sind 30-61 kDa Monomere Proteine, die erfordern keine posttranslationale Verarbeitung für enzymatische Aktivität und als genetische Reporter unmittelbar nach Übersetzung funktionieren können. Sobald das Substrat des Enzyms Luciferase zuordnet, erzeugt die biochemische Reaktion katalysiert einen Lichtblitz. Somit sind die Luciferase Konstrukte als gen Ausdruck Reporter System in Vitro und in Vivoverbreitet. Im zirkadianen Rhythmus-Studien, das Dienstprogramm der Luciferase Reporter ist jedoch begrenzt durch die relativ lange Halbwertszeit des Proteins Luciferase (T1/2 = 3,68 h) im Vergleich zum Zeitraum (vor allem auf den kurzen Zeitraum) für Änderungen im zirkadianen gen Ausdruck; Allerdings haben zahlreiche Studien über die Jahre erfolgreich eingesetzt das Luciferase-gen im pGL3 Vektor, darauf hinweist, dass schnell abbaubar Luciferase möglicherweise nicht für die zirkadianen Rhythmen, speziell für die Rhythmen mit einen längeren Zeitraum, wie z. B. Berichterstattung erforderlich 24 h. Daher hat ein Reporter Plasmid mit destabilisiert Luciferase Vektor, pGL [Luc2P/Neo], die hPEST (eine Proteinsequenz Destabilisierung) enthält entwickelt, ermöglicht es uns, als einen zirkadianen Reporter Vektor für unser aktuelles in-vitro-verwenden, Biolumineszenz-Assay. Das Protein kodiert, indem Luc2P hat eine viel kürzere Halbwertszeit (T1/2 = 0,84 h) und somit schneller und mit einem größeren Ausmaßes reagiert auf Änderungen in transkriptionelle Aktivität als Wildtyp-ichNdicating, das es sein kann, verwendet, um den rhythmischen Ausdruck der Luciferase geregelt durch den Projektträger PER2 akkurat in Echtzeit-16zu überwachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Periodizität der circadianen Uhr unterliegt in Säugerzellen miteinander verbundenen transkriptionelle/translationale Feedback-Schleifen. Heterodimere Bmal1 und Uhr oder Npas2 regulieren zirkadiane Transkription durch Bindung an E-Box-Elemente in die Promotoren des Kerns CGs, einschließlich Per2 und Schreiund zahlreiche CCGs4. Wie sie in der Zelle, Heterodimere der sammeln pro: Schrei sind posttranslational modifiziert und transportiert in den Zellkern, Uhr: Bmal1 transkription…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch 2012 Gesellschaft für Toxikologie (SOT)-Colgate Palmolive Grant für Alterative Forschung (M. Reißzahn) und die internationale Zusammenarbeit-Forschung zu finanzieren, von Tier und Pflanze Quarantäne, Republik Korea (M. Fang), und gewähren den NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Wir möchten danken Dr. Zheng Chen (McGovern Medical School an der University of Texas Health Science Center in Houston), für seine hilfreiche Diskussion, Mr Shao-An Juan für seine experimentelle Unterstützung und Frau Kimi Nakata für ihr Korrekturlesen.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
Referências
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