במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב
Summary
וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה כדי לקבוע סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב מוצג. שיטה זו משתמשת בתרבית של תאים כתב פלסמידים לבטא גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז תחת השליטה של האמרגן ג’ין תקופה 2 . זה ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים כדי להעריך את ההשפעות איבר ספציפי על שעון ביולוגי.
Abstract
שעון ביולוגי הוא היסוד תהליך פיזיולוגי נוכח כל האורגניזמים מווסת תהליכים ביולוגיים החל ביטוי גנים לישון התנהגות. גולגולת, שעון ביולוגי נשלטת על ידי מתנד מולקולרית המתפקד הן תצלובתי (SCN; קוצב הלב המרכזית) והן תאים בודדים הכוללת רקמות היקפיים ביותר. חשוב מכך, שיבוש בשעון הביולוגי על ידי חשיפה לאור בלילה, לחצים סביבתיים ו/או חשיפה לרעלים משויך סיכון מוגבר של מחלות כרוניות והזדקנות. היכולת לזהות סוכנים יכול לשבש שעונים ביולוגיים מרכזי ו/או ציוד היקפי, וסוכני שניתן למנוע או להקטין את ההשפעות של שיבוש היממה, השלכות משמעותיות לצורך מניעת מחלות כרוניות. אף על פי מודלים מכרסמים יכול לשמש כדי לזהות חשיפות וסוכנים לגרום או למנוע/לצמצם שיבושים היממה, ניסויים אלה מחייבים מספרים גדולים של בעלי חיים. מחקרים in vivo גם דורשים תשתיות ומשאבים רבים, והן דורשות לחוקרים לעבוד כל הלילה. לפיכך, יש צורך דחוף עבור סוג התא המתאים במבחנה מערכת עבור הסביבה משבשים היממה, משפרי סוגי תאים מסך של איברים שונים ועם מצבי מחלה. אנחנו נבנה וקטור שמניע שעתוק של לוציפראז destabilized התאים האיקריוטים תחת השליטה של האמרגן גנים אנושיים פרק 2 . המבנה הזה, כתב היממה היה transfected stably לתוך תאי האפיתל החלב אדם, היממה כתב מגיבים תאים נבחרו כדי לפתח את הבדיקה ביולומינסנציה במבחנה . כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור ולאמת וזמינותו. בהמשך, אנו מספקים פרטים להוכחת ניסויים קונספט להפגין את יכולתם של שלנו assay במבחנה מסכם את הדברים ויוו השפעת כימיקלים שונים על השעון הביולוגי הסלולר. התוצאות מצביעות על כך וזמינותו ניתן להתאים מגוון רחב של סוגי תאים על המסך עבור משבשים סביבתיים והן משפרי chemopreventive משעונים היממה.
Introduction
השעון היממה מווסת את מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים ההשתנות היומית הביטוי של הגנים לשכב התנהגות בקצב צפוי תקופתיות של 24 ח’ אפידמיולוגיים מחקרים ממליצים כי הפרעה כרונית של היממה קצב מגביר את הסיכון של השד, סרטן הערמונית אצל עובדי משמרת, כולל אחיות וטיסה קרוז1,2,3. ממצאים אלה הם שחלקית מחקרים מכרסמים, הוכחת חשיפה מתמדת אור, אור בלילה, או אור מחזורים לחקות ג’ט-לג עלייה גידול שכיחות ומאיץ הגידול צמיחה4,5. על סמך נתונים ממחקרים אנושיים וטכנולוגיים מכרסמים, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן המסווגים עבודה במשמרת קרצינוגן אדם סביר (סוג 2A) 20106.
בעבר, להדגים זאת מסרטנים מנה אחת של החלב גידול ספציפי מסרטן, N– nitroso-N– methylurea (NMU), שיבשו את הביטוי היממה של הגנים העיקריים היממה (CGs) (למשל, פרק 2 , Per2) ואת מספר היממה מבוקר גנים (CCGs), כולל מפתח נזק לדנ א מגיבים ותיקון גנים (DDRR) בבלוטת החלב היעד (אך לא את הכבד). יתר על כן, איפוס הביטוי היממה של גנים הן Per2 והן DDRR לכיוון הרגיל על-ידי משטר chemopreventive של התזונה L-מתיל-selenocysteine (MSC) מופחת השכיחות של הגידול בשיעור של 63%. ממצאים אלה היו הראשונים כדי להציג קישור מכניסטית בין שעון ביולוגי, כימי carcinogenesis chemoprevention7,8. חשיפות אחרים חשיפה לרעלים סביבתיים שמוצג כדי לשבש את ג’ין היממה ביטוי ויוו קשורים גם עם סיכון מוגבר של מחלות הסביבה9,10. הבנת המנגנונים לקשר שיבוש סדר היום על ידי חשיפה לרעלים סביבתיים ו פתוגנזה עלול להוביל גישות מבוססות mechanistically למניעת מחלות. עם זאת, מחקרים במטרה להגדיר את האינטראקציות בין החשיפות, שעון ביולוגי מבוצעות בדרך כלל ויוו. טיפוסי ויוו ניסוי חוקר שההשפעה על שעון ביולוגי דורשת מספרים גדולים של בעלי חיים, כמו רקמות לפחות שלושה לשלוט וצריך שלוש חיות חשוף אסף h כל 3-4 על פני תקופה h 24 או 48. התפתחות מערכת המאומת במבחנה אשר recapitulates ויוו תצפיות ומנגנונים ולכן לא רק להפחית את מספר בעלי החיים הנדרש, אבל גם באופן דרמטי להפחית עלויות ניסיוני הדרישה כי חוקרים לעבוד ברציפות במשך 24-48 שעות. יתר על כן, ניתן להשתמש במערכת מאומתים במבחנה להקרנה תפוקה גבוהה של תרכובות ו/או שינוי גנטי המשפיעים על שעון ביולוגי, או את תגובתה לחצים סביבתיים או חשיפה לרעלים. לפיכך, שילוב האסטרטגי במבחנה ויוו דגמים וניסויים נדרשים להשיג תובנות שונות עם מיקוד שונה.
ביונקים, מתנדים היממה קיים לא רק נוירונים מיוחדים של SCN, אלא גם בסוגי תא ביותר היקפיים. השעונים מולקולרית דומים לאלה שורות תאים פיברובלסט הוקמה, ראשי fibroblasts עוברי או למבוגרים בעלי חיים; עם זאת, יש צורך רקמה דגמי הסלולר ייחודיים לסוג11. כתוצאה מכך, מחקרים המסורתי של פעילות גינקולוגיות ויוו, SCN explants ex-vivo, מבוססת-תא במבחנה מבחני תאי פיברובלסט מונצחים נמצאים בשימוש נרחב ללמוד פגמים היממה תא-אוטונומי. אולם, אין ראיות המציין כי במבחנה פיברובלסט מבוססת תא assay יכול לסכם מנגנונים היממה, תגובות להציג בתאים של אחרים איברים היקפיים ויוו. סוגי תאים שונים יכול יש דפוסים ברורים של ביטוי גנים, חילוף החומרים xenobiotic ו- DDRR, הקישורים בין רעילות היממה גנים עשויים להיות תא מסוג מסוים ו/או מאופנן על ידי פרמטרים פיזיולוגיים שונים. בנוסף, מתנדים היממה במערכות מבוססות פיברובלסט לא היה מלא להעריך תגובות חשיפה לרעלים סביבתיים, לחצים של סוכני מניעה לקשר חשיפות מנגנוני התפתחות מחלות ומניעה. לפיכך, יש צורך נתיישב, לאמת תאים מסוג ספציפי, במבחנה ביולומינסנציה מבחני ללמוד משבשים היממה סביבתי ספציפי איברים. למרות מגוון דגמים שעון סלולרי (למשל, הכבד, keratinocytes, תאי שומן, כמו גם קו תא אוסטאוסרקומה) פותחו בשנים האחרונות12,13,14, 15, וזמינותו המתוארים כאן הוא המודל שעון סלולרי הראשון תאים אפיתל בשד, ההפגנה הראשונה כדי לסכם תגובות ויוו לחצים סביבתיים, חשיפה לרעלים, סמים של סוכנים chemopreventive.
לוציפראז Renilla (rLuc) גחלילית לוציפראז 30-61 kDa monomeric חלבונים אשר אינם דורשים posttranslational עיבוד אנזימטי לפעילות, יכול לתפקד בתור כתבת גנטי מיד עם תרגום בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. ברגע המצע משייכת האנזים לוציפראז, התגובה הביו מזורז יוצר הבזק של אור. לפיכך, בונה לוציפראז נמצאים בשימוש נרחב ג’ין ביטוי כתב מערכת במבחנה , בתוך vivo. עם זאת, במחקרים שעון ביולוגי, השירות של הכתב לוציפראז מוגבל על ידי מחצית החיים ארוך יחסית של החלבון לוציפראז (T1/2 = 3.68 h) ביחס התקופה (במיוחד כדי לתקופה קצרה) לקראת שינויים ג’ין היממה ביטוי; עם זאת, מחקרים רבים לאורך השנים השתמשו בהצלחה את הגן לוציפראז ב וקטור pGL3, המציין לוציפראז מתכלה במהירות ייתכן שלא יהיה צורך לדיווח מקצבים השעון הביולוגי, במיוחד עבור הקצב עם תקופה ארוכה יותר, כגון h 24 שעות ביממה. לכן, כתב פלסמיד באמצעות וקטור לוציפראז גרם אולי לפגיעה ביציבות, pGL [Luc2P/Neo], המכיל hPEST (חלבון הקשורה רצף) פותחה, ומאפשר לנו להשתמש בו כמו וקטור היממה כתב עבור שלנו זרם במבחנה ביולומינסנציה וזמינותו. החלבון המקודד על ידי Luc2P יש הרבה מחצית חיים קצר יותר (T1/2 = 0.84 h), ומכאן, מגיב מהר יותר, בעוצמה גדולה יותר לשינויים בפעילות תעתיק יותר פראי-סוג, אניndicating כי ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר הביטוי האומנותית של לוציפראז מוסדר על ידי האמרגן PER2 במדויק ב בזמן אמת16.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתרבית של תאים, תקופתיות של שעון היממה מוסדר על ידי לולאות משוב תעתיק/translational מחובררים. Heterodimers של Bmal1, שעון או Npas2 לווסת שעתוק היממה על-ידי איגוד E-box רכיבי ב היזמים של ליבה הרמטכ ל, כולל Per2 לבכות, ואני CCGs רבים4. ככל שהם צוברים בתא, heterodimers של כל: לבכות post-translationally שונה, מועבר …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי 2012 החברה של רעלים (אויל)-קולגייט פלמוליב מענק למחקר Alterative (פאנג מ’) ועל המחקרים שיתוף פעולה בינלאומי קרן חיה, צמח הסגר סוכנות, הרפובליקה של קוריאה (פאנג מ’), ולהעניק NIEHS P30ES005022 (ה Zarbl). ברצוננו להודות ג’נג ד ר צ’ן (מקגוורן הספר לרפואה של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון) לדיון מועיל שלו, מר חואן Shao-An על עזרתו ניסיוני, גב’ נקאטה Kimi לקריאה הוכחה שלה.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
Referências
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson’s disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. . Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. . Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
