浸透圧ポンプまたは直接的筋肉注射を用いる皮下ニューロトロフィン4注入は、老齢ラット喉頭筋を増強する
Summary
ここでは、ラットの老化喉頭筋をリモデリングするために、ニューロトロフィン4（NTF4）の使用を全身的かつ直接的に記述するためのプロトコールを提示する。
Abstract
高齢者における喉頭機能不全は、声調障害から嚥下障害および気道保護反射障害の主要な原因である。年齢関連の喉頭筋機能不全を対象とする治療法は、あるとしてもごくわずかです。ニューロトロフィンは、神経筋接合部（NMJ）の筋肉の神経支配および分化に関与する。神経栄養因子は、神経伝達物質放出を増加させることによって神経筋伝達を増強すると考えられている。神経筋接合部（NMJ）は、ラットの喉頭筋の老化において、機能低下を示す証拠とともに、より小さく、豊富ではない。私たちは、ヒトの喉頭筋の高齢化における機能を改善するための治療薬としての将来の臨床用途へのNTF4の影響を探った。ここでは、NTF4の適用に応答してラット喉頭筋の老化能力を調べるための、NTF4の全身投与および直接注射のための詳細なプロトコールを提供する。この方法では、ラットはNTF4を全身的に oまたは声帯を介して直接注入することによって行われる。喉頭筋を解剖し、形態学および年齢関連の脱神経の組織学的検査に用いた。
Introduction
喉頭の筋肉は急速かつ一貫して収縮し、老化の悪影響を受け易い。この一定の活動は、65歳以上の人の1日 、 2日 、 3日 、 4日 、 5日 、 6日 、 7日に観察される声の問題または嚥下障害に寄与すると考えられている。いくつかの分子的および病態生理学的機序がこの年齢関連機能不全に寄与する。これらのメカニズムには、喉頭粘膜の改造、筋繊維萎縮または喪失、筋繊維再生の欠如、または声帯の屈曲および声門閉鎖の不可能化を引き起こす萎縮が含まれ得る（8,9,10,11）。現時点で実証された治療法はありませんこれらの筋肉の年齢に関連した変化を徹底的に防止またはリハビリします。
神経筋伝達の有効性の調節は、神経運動の性能に大きく影響する可能性がある。ニューロトロフィンのファミリーには、神経成長因子（NGF）、脳由来神経成長因子（BDNF）、ニューロトロフィン3（NTF3）およびNTF4 12,13が含まれる 。ニューロトロフィンは、シナプスの効力を調節することが示されている1,4 。肝細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータおよび線維芽細胞成長因子は、最近、ヒトにおいて声帯瘢痕の治療のために使用されている15-17。 NTF4はNMJの有効性も規制している。 NTF4を欠くマウスは、分解されたNMJ11,18,19を示す。これらの研究は、治療薬の有望な効果をもたらす老人性喉頭筋障害の老化および成長因子による衰弱。
声帯の組織への直接注射療法は、ヒトにおいて前例のないことではない。例えば、ボツリヌス毒素の局所注入は、現在、喉頭の筋肉に影響を与える神経運動障害、例えば痙攣性発声障害および両側性再発性喉頭神経麻痺に対する有効な治療として使用されている20,21 。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、別の注射剤であり、声帯怖さと声門不全を治療するために使用される22,23 。注射喉頭形成術は、様々なコミュニケーション障害を治療するために使用することができる24 。これらの直接注射方法は、高齢者の声機能および嚥下を改善することを約束している。
Protocol
このプロトコールには、オスのFischer 344-Brownノルウェーラットを6ヶ月齢および30ヶ月齢で使用する。ラットは国立老化げっ歯類コロニーから入手した。ラット喉頭の構造はヒトのものと類似しており、機能的に気道保護および種特異的発声に役立つので、この研究のためにラットを使用した。この研究は、実験動物の人間のケアおよび使用に関するPHS方針に従って行われ、実験動物のケアお?…
Representative Results
2週間の浸透圧ポンプ注入後またはNTF4の直接注入後1週間後にラットを安楽死させた。喉頭を収穫し、凍結保護剤（30％スクロースおよび70％リン酸緩衝生理食塩水）に入れ、次にクライオスタットで10μmの幅で連続的に切片化した。高齢の喉頭筋はNTF4の投与によって影響を受ける25 。若年ラットおよび老齢ラットに加えて、我々は、甲状腺機能亢進?…
Discussion
喉頭の筋肉は、老化の好ましくない影響を受け易い。以前の研究では、収縮機能およびミオシンアイソフォームシフトの変化に加えて、繊維サイズの変化、繊維の総数、再生能力、NMJサイズおよび量の変化を含む老齢喉頭筋の変化が示されている4,11,27,30,31 。高齢の喉頭筋は、ニューロトロフィンの適用によって変化させることができる。これらの変化は容易に測定することができる。した?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立難聴者およびその他のコミュニケーション障害研究所（R21DC010806からCAMおよびJCSおよびR01DC011285からCAMへの助成金）の支援を受けました。
Materials
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200ng in 50μl |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50mm 30 gauge 100-μl syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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Citar este artigo
Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).