I situ Immunofluorescerende farging av autophagy i muskelstamceller
Summary
Aktiv autofagi er assosiert med produktiv muskelregenerasjon, noe som er viktig for aktivering av muskelstamceller (MuSC). Her gir vi en protokoll for in situ- deteksjon av LC3, en autophagy markør i MyoD-positive MuSCs av muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus.
Abstract
Økende bevis peker mot autophagy som en avgjørende reguleringsprosess for å bevare vevshemostost. Det er kjent at autofagi er involvert i utvikling av skjelettmuskulatur og regenerering, og den autofagiske prosessen er beskrevet i flere muskulære patologier og aldersrelaterte muskelforstyrrelser. En nylig beskrevet blokk av autofagisk prosess som korrelerer med funksjonell utmattelse av satellittceller under muskelreparasjon støtter ideen om at aktiv autofagi er kombinert med produktiv muskelregenerering. Disse dataene avdekker den avgjørende rollen som autofagi ved satellittcelleaktivering under muskelregenerering i både normale og patologiske forhold, som for eksempel muskeldystrofier. Her gir vi en protokoll for å overvåke autofagisk prosess i voksen Muscle Stem Cell (MuSC) -kammeret under muskelregenerative forhold. Denne protokollen beskriver oppsettmetoden for å utføre in situ immunofluorescensavbildning av LC3, en aUtophagy markør, og MyoD, en myogen linjemarkør, i muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus. Metoden som rapporteres muliggjør overvåking av den autofagiske prosessen i et spesifikt cellefelt, MuSC-kammeret, som spiller en sentral rolle for orkestrering av muskelregenerering.
Introduction
Skeletmuskleregenerering er resultatet av samspillet mellom voksne stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) og andre celletyper som er involvert i den regenerative prosessen. Muskel homeostase og funksjonalitet opprettholdes av de kombinerte signalene som oppstår fra muskelnissen og systemiske tegn 1 , 2 . Gjennom hele levetiden er endringer i MuSC-funksjonaliteten, muskelnissen og de systemiske signalene blitt rapportert, noe som fører til nedgangen i funksjonell kapasitet hos eldre 3 . MuSCs er satt i en nisje under basal lamina og, ved muskelskade, aktiveres for å reparere skadede muskler 4 , 5 . For å sikre en produktiv regenerativ respons er det avgjørende at MuSCs koordinerer forskjellige prosesser som er nødvendige for utgang fra hvile, selvfornyelse og det proliferative ekspansjonsstadiet fulgtVed myogen differensiering 6 . Hos eldre og muskulære kroniske sykdommer er alle disse funksjonene kompromittert, noe som fører til endret muskelfunksjonalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Makroautofagi (referert heretter som autofagi) oppstår som en avgjørende biologisk prosess som er avgjørende for å bevare vevshomeostase 14 . Den autofagiske prosessen innbefatter handelsmekanismer, hvor deler av cytoplasma, organeller og proteiner blir oppslukt i vesikler som til slutt nedbrytes via lysosomveien, fremmer fjerning av toksiske molekyler og resirkulering av makromolcules. Dette gir energirike forbindelser for å støtte celle- og vevtilpasning under stress eller andre ugunstige forhold 15 , 16 . Sammen med sin celleoverlevelsesaktivitet kan autofagi også fungere som en celledødsinducer, avhengig av cellevevskontekst ( f.eks. Normalt versus kreftvev) og typen stressstimulus 17 , 18 .
Nylige bevis indikerer at autofagi er nødvendig for å opprettholde muskelmasse og myofiberintegritet 19 , 20 og har blitt rapportert å være svekket i forskjellige muskeldystrofier 21 , 22 , 23 , inkludert Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP , 28 , 29 , 30. På samme måte har en progressiv reduksjon av den autofagiske prosessen blitt observert hos eldre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , etter tap av muskelmasse (referert til som sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og i myofiber overlevelse 38 .
Et nært forhold mellom autophagy og regenerativ potensial av skjelettmuskulaturen var forventet ved en studie fra Wagers laboratorium, som viste at en kaloribegrensning øker MuSC tilgjengelighet og aktivitet 39 . Dette nrBle ytterligere støttet av den nylige observasjonen at Foxo3-Notch-aksen aktiverer den autofagiske prosessen under selvfornyelse 40 og MuSC-overgangen fra hvilende til proliferasjonsstaten 41 . Disse dataene stemmer overens med den progressive reduksjonen av basal autofagi fra unge til gamle og geriatriske MuSCs, i forbindelse med den numeriske og funksjonelle nedgangen av MuSCs under aldring 42 .
I et nylig papir viste vi et nært forhold mellom autophagy og kompenserende muskelregenerering som skiller de tidlige stadier av DMD-progresjon. Følgelig observert vi en redusert autofagisk fluss ved senere stadier av sykdomsprogresjon, når muskelregenerering er kompromittert og fibrotisk vevsdeposisjon oppstår. Oppsiktsvekkende viste vi at i regenererende tilstander aktiveres autofagi i MuSCs og den modulerende autofagiske prosessen påvirker MuSC-aktivering og fuNasjonalitet 30 .
Samlet sett fremhever disse dataene haster for å undersøke den autofagiske prosessen i MuSCs under muskelregenerering under normale og patologiske forhold og gjennom hele levetiden. Her gir vi en protokoll for å overvåke autofagisk prosess i muskelregenerative tilstander ved å utføre in situ immunostaining for mikrotubulær assosiert protein 1A / 1B-lettkjede 3 (LC3), en markør for autophagy 43 og MyoD, en markør for Myogen linje, i muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus. Metoden som rapporteres muliggjør overvåking av den autofagiske prosessen i et spesifikt cellefelt, MuSC, som spiller en nøkkelrolle i orkestrering av muskelregenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan man overvåker autofagi i skjelettmuskulaturstamceller under kompenserende muskelregenerering. Flere antistoffer for co-farging av LC3 og MyoD ble prøvd, og de som jobber i musvevsnitt og oppretter vellykkede resultater, er oppført her (se Materialebord ). Permeabiliseringen med metanol (se trinn 3.2.2) anbefales sterkt for vellykket farging.
Begrensningen av denne protokollen er knyttet til musens indre variabilitet, noe som tving…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT til LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Referências
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
