Aktiv autofagi er assosiert med produktiv muskelregenerasjon, noe som er viktig for aktivering av muskelstamceller (MuSC). Her gir vi en protokoll for in situ- deteksjon av LC3, en autophagy markør i MyoD-positive MuSCs av muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus.
Økende bevis peker mot autophagy som en avgjørende reguleringsprosess for å bevare vevshemostost. Det er kjent at autofagi er involvert i utvikling av skjelettmuskulatur og regenerering, og den autofagiske prosessen er beskrevet i flere muskulære patologier og aldersrelaterte muskelforstyrrelser. En nylig beskrevet blokk av autofagisk prosess som korrelerer med funksjonell utmattelse av satellittceller under muskelreparasjon støtter ideen om at aktiv autofagi er kombinert med produktiv muskelregenerering. Disse dataene avdekker den avgjørende rollen som autofagi ved satellittcelleaktivering under muskelregenerering i både normale og patologiske forhold, som for eksempel muskeldystrofier. Her gir vi en protokoll for å overvåke autofagisk prosess i voksen Muscle Stem Cell (MuSC) -kammeret under muskelregenerative forhold. Denne protokollen beskriver oppsettmetoden for å utføre in situ immunofluorescensavbildning av LC3, en aUtophagy markør, og MyoD, en myogen linjemarkør, i muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus. Metoden som rapporteres muliggjør overvåking av den autofagiske prosessen i et spesifikt cellefelt, MuSC-kammeret, som spiller en sentral rolle for orkestrering av muskelregenerering.
Skeletmuskleregenerering er resultatet av samspillet mellom voksne stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) og andre celletyper som er involvert i den regenerative prosessen. Muskel homeostase og funksjonalitet opprettholdes av de kombinerte signalene som oppstår fra muskelnissen og systemiske tegn 1 , 2 . Gjennom hele levetiden er endringer i MuSC-funksjonaliteten, muskelnissen og de systemiske signalene blitt rapportert, noe som fører til nedgangen i funksjonell kapasitet hos eldre 3 . MuSCs er satt i en nisje under basal lamina og, ved muskelskade, aktiveres for å reparere skadede muskler 4 , 5 . For å sikre en produktiv regenerativ respons er det avgjørende at MuSCs koordinerer forskjellige prosesser som er nødvendige for utgang fra hvile, selvfornyelse og det proliferative ekspansjonsstadiet fulgtVed myogen differensiering 6 . Hos eldre og muskulære kroniske sykdommer er alle disse funksjonene kompromittert, noe som fører til endret muskelfunksjonalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Makroautofagi (referert heretter som autofagi) oppstår som en avgjørende biologisk prosess som er avgjørende for å bevare vevshomeostase 14 . Den autofagiske prosessen innbefatter handelsmekanismer, hvor deler av cytoplasma, organeller og proteiner blir oppslukt i vesikler som til slutt nedbrytes via lysosomveien, fremmer fjerning av toksiske molekyler og resirkulering av makromolcules. Dette gir energirike forbindelser for å støtte celle- og vevtilpasning under stress eller andre ugunstige forhold 15 , 16 . Sammen med sin celleoverlevelsesaktivitet kan autofagi også fungere som en celledødsinducer, avhengig av cellevevskontekst ( f.eks. Normalt versus kreftvev) og typen stressstimulus 17 , 18 .
Nylige bevis indikerer at autofagi er nødvendig for å opprettholde muskelmasse og myofiberintegritet 19 , 20 og har blitt rapportert å være svekket i forskjellige muskeldystrofier 21 , 22 , 23 , inkludert Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP , 28 , 29 , 30. På samme måte har en progressiv reduksjon av den autofagiske prosessen blitt observert hos eldre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , etter tap av muskelmasse (referert til som sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og i myofiber overlevelse 38 .
Et nært forhold mellom autophagy og regenerativ potensial av skjelettmuskulaturen var forventet ved en studie fra Wagers laboratorium, som viste at en kaloribegrensning øker MuSC tilgjengelighet og aktivitet 39 . Dette nrBle ytterligere støttet av den nylige observasjonen at Foxo3-Notch-aksen aktiverer den autofagiske prosessen under selvfornyelse 40 og MuSC-overgangen fra hvilende til proliferasjonsstaten 41 . Disse dataene stemmer overens med den progressive reduksjonen av basal autofagi fra unge til gamle og geriatriske MuSCs, i forbindelse med den numeriske og funksjonelle nedgangen av MuSCs under aldring 42 .
I et nylig papir viste vi et nært forhold mellom autophagy og kompenserende muskelregenerering som skiller de tidlige stadier av DMD-progresjon. Følgelig observert vi en redusert autofagisk fluss ved senere stadier av sykdomsprogresjon, når muskelregenerering er kompromittert og fibrotisk vevsdeposisjon oppstår. Oppsiktsvekkende viste vi at i regenererende tilstander aktiveres autofagi i MuSCs og den modulerende autofagiske prosessen påvirker MuSC-aktivering og fuNasjonalitet 30 .
Samlet sett fremhever disse dataene haster for å undersøke den autofagiske prosessen i MuSCs under muskelregenerering under normale og patologiske forhold og gjennom hele levetiden. Her gir vi en protokoll for å overvåke autofagisk prosess i muskelregenerative tilstander ved å utføre in situ immunostaining for mikrotubulær assosiert protein 1A / 1B-lettkjede 3 (LC3), en markør for autophagy 43 og MyoD, en markør for Myogen linje, i muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus. Metoden som rapporteres muliggjør overvåking av den autofagiske prosessen i et spesifikt cellefelt, MuSC, som spiller en nøkkelrolle i orkestrering av muskelregenerering.
Denne protokollen beskriver hvordan man overvåker autofagi i skjelettmuskulaturstamceller under kompenserende muskelregenerering. Flere antistoffer for co-farging av LC3 og MyoD ble prøvd, og de som jobber i musvevsnitt og oppretter vellykkede resultater, er oppført her (se Materialebord ). Permeabiliseringen med metanol (se trinn 3.2.2) anbefales sterkt for vellykket farging.
Begrensningen av denne protokollen er knyttet til musens indre variabilitet, noe som tving…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT til LL
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |