筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining
Summary
アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。
Abstract
組織ホメオスタシスを保存するための重要な調節プロセスとして、自食作用が指摘されています。オートファジーは骨格筋の発達と再生に関与していることが知られており、オートファジー過程はいくつかの筋肉病変および加齢に関連する筋肉疾患に記載されている。筋修復中の衛星細胞の機能的枯渇と相関する、最近記載された自食プロセスのブロックは、能動的な自食作用が生産的な筋再生と結びついているという考えを支持する。これらのデータは、筋ジストロフィーのような正常および病的状態の両方における筋肉再生中の衛星細胞活性化におけるオートファジーの重要な役割を明らかにする。ここでは、筋肉再生条件下での成体筋幹細胞（MuSC）コンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコールを提供する。このプロトコールは、LC3のインサイチュ免疫蛍光イメージングを行うためのセットアップ方法論を説明している。対照マウスおよび損傷マウスからの筋肉組織切片中の筋原性マーカーであるMyoDとの間の相互作用を示す。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋肉再生を調整する中心的な役割を果たすMuSCコンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。
Introduction
骨格筋再生は、成体幹細胞（Muscle Satellite Cells、MuSCs）と再生過程に関与する他の細胞型との相互作用の結果である。筋肉の恒常性および機能性は、筋肉のニッチおよび全身的な手掛かり1,2から生じる信号を組み合わせることによって維持される。生涯にわたって、MuSC機能、筋肉のニッチ、および全身手がかりの変化が報告され、高齢者の機能的能力の低下3につながる。 MuSCは基底板の下のニッチに設置され、筋肉傷害時に損傷筋肉を修復するために活性化される4,5 。生産的な再生応答を確実にするためには、MuSCが静止からの退出、自己再生、および増殖の拡大段階に必要な異なるプロセスを調整することが重要である筋原性分化6 。高齢者および筋肉慢性疾患では、これらの機能が全て損なわれ、筋機能が変化する（2,3,6,7,8,9,10,11,12,13）。
マクロオートファジー（以下、オートファジーと呼ぶ）は、組織恒常性を維持するために不可欠な重要な生物学的プロセスとして浮上している14 。自食プロセスは、細胞質、細胞小器官、およびタンパク質の一部が最終的にリソソーム経路を介して分解されて小胞に包み込まれ、毒性分子の除去およびマクロモールのリサイクルを促進する輸送メカニズムを包含するcules。これは、ストレスまたは他の悪条件の下での細胞および組織の適応を支援するためのエネルギー豊富な化合物を提供する15,16 。オートファジーは、その細胞生存活性と共に、細胞組織の状況（ 例えば、正常組織と癌組織）およびストレス刺激のタイプに依存して、細胞死誘導因子として働くことができる17,18 。
最近の証拠によれば、オートファジーは筋肉量および筋線維の完全性を維持するために必要とされる19,20 、 Duchenne筋ジストロフィー（DMD）を含む異なる筋ジストロフィー21,22,23で障害されることが報告されている24,25,26,27 </su同様に、筋肉量の喪失（サルコペニアと呼ばれる）後の高齢者31,32,33,34,35において、自食作用の進行性低下が観察されている32,33,34（p> 、 28,29,30）。 、 35,36,37 、筋電図の生存38 。
オートファジーと骨格筋の再生能力との密接な関係は、カロリー制限がMuSCの利用可能性と活性を高めることを示したWagers研究所の研究によって予想された39 。これはいいえFoxo3-Notch軸が自己再生中に自食作用過程を活性化し、MuSCが静止状態から増殖状態に移行するという最近の観察によってさらに支持された41 。これらのデータは、老化中のMuSCの数値的および機能的低下に関連して、若年から老齢および老人性のMuSCからの基礎的な自食作用の進行的な減少と一致する42 。
最近の論文では、DMDの進行の初期段階を区別する自食作用と代償性筋再生との間に密接な関係があることを示した。従って、我々は、筋肉の再生が損なわれ、線維性組織沈着が起こる、疾患の進行の後期段階で減少した自食作用の流出を観察した。興味深いことに、我々は、再生条件において、オートファジーがMuSCにおいて活性化され、オートファジープロセスを調節することがMuSC活性化およびfuに影響を及ぼすことを示した法律30 。
まとめると、これらのデータは、正常および病理学的状態および生涯にわたる筋肉再生中のMuSCにおける自食作用プロセスを探索する緊急性を強調している。ここでは、オートファジー43のマーカーである微小管関連タンパク質1A / 1B軽鎖3（LC3）およびMyoDマーカーのin situ免疫染色を行うことにより、筋再生状態におけるMuSCにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコルを提供する。筋原性系統、対照および損傷マウス由来の筋肉組織切片中に存在する。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋再生を調整する上で重要な役割を果たすMuSCにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールは、代償性筋再生中に骨格筋幹細胞におけるオートファジーをモニターする方法を記載する。 LC3とMyoDの同時染色のためのいくつかの抗体が試され、マウス組織切片で働き、成功した結果を創り出す抗体がここに掲載されています（ 材料表を参照）。メタノールによる透過処理（ステップ3.2.2参照）は、染色を成功させるために強く推奨されます。
<p clas…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIAMS AR064873、Epigen Project PBによって支持された。 P01.001.019 / Progetto BandieraエピゲノムIFTからLL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Referências
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
