Aktiv autofagi er forbundet med produktiv muskelregenerering, hvilket er afgørende for aktivering af muskelstamceller (MuSC). Her tilvejebringer vi en protokol til in situ detektion af LC3, en autophagy markør i MyoD-positive MuSCs af muskelvævssektioner fra kontrol og skadede mus.
Øget bevis peger på autofag som en afgørende reguleringsproces for at bevare vævshomostase. Det er kendt, at autofagi er involveret i udvikling af skeletmuskel og regenerering, og den autofagiske proces er blevet beskrevet i flere muskulære patologier og aldersrelaterede muskelforstyrrelser. En nyligt beskrevet blok af den autofagiske proces, der korrelerer med den funktionelle udtømning af satellitceller under muskelreparation, understøtter forestillingen om, at aktiv autofagi er koblet til produktiv muskelregenerering. Disse data afdækker den afgørende rolle autofagi i satellitcelleaktivering under muskelregenerering i både normale og patologiske tilstande, såsom muskeldystrofier. Her tilvejebringer vi en protokol til overvågning af autophagic-processen i voksen muskelstamceller (MuSC) under muskelregenerative betingelser. Denne protokol beskriver opsætningsmetoden til at udføre in situ immunofluorescensbilleddannelse af LC3, en aUtophagy markør og MyoD, en myogen linie markør, i muskelvæv sektioner fra kontrol og skadede mus. Den rapporterede metode muliggør overvågning af den autofagiske proces i et specifikt cellerum, MuSC-rummet, som spiller en central rolle i orkestrerende muskelregenerering.
Skeletmuskleregenerering er resultatet af interaktionen mellem voksne stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) og andre celletyper, der er involveret i den regenerative proces. Muskel homeostase og funktionalitet opretholdes af de kombinerede signaler, der stammer fra muskel niche og systemiske tegn 1 , 2 . Gennem hele levetiden er der rapporteret om ændringer i MuSC-funktionaliteten, muskelnichen og de systemiske signaler, hvilket resulterer i tilbagegang i funktionelle kapaciteter hos ældre 3 . MuSCs er sat i en niche under basal lamina og ved muskelskade aktiveres for at reparere beskadigede muskler 4 , 5 . For at sikre et produktivt regenerativt respons er det afgørende, at MuSCs koordinerer forskellige processer, der er nødvendige for udgangen fra quiescence, selvfornyelsen og den proliferative ekspansionsstadium fulgtVed myogen differentiering 6 . Hos ældre og muskulære kroniske sygdomme er alle disse funktioner kompromitteret, hvilket fører til ændret muskelfunktionalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Makroautofagi (herefter omtalt som autofagi) fremkommer som en afgørende biologisk proces, der er afgørende for at bevare vævshomostase 14 . Den autophagiske proces omslutter menneskehandel mekanismer, hvor dele af cytoplasma, organeller og proteiner opsluges i vesikler, der til sidst nedbrydes via lysosomvejen, fremmer fjernelsen af toksiske molekyler og genanvendelse af makromolcules. Dette giver energirige forbindelser til understøttelse af celle- og vævsadaptation under stress eller andre ugunstige tilstande 15 , 16 . Sammen med sin celleoverlevelsesaktivitet kan autophagi også fungere som en celledødsinducer, afhængig af cellevævskontekst ( fx normalt versus kræftvæv) og typen af stress-stimulus 17 , 18 .
Nylige beviser tyder på, at autofagi er nødvendig for at opretholde muskelmasse og myofiberintegritet 19 , 20 og er blevet rapporteret at være svækket i forskellige muskeldystrofier 21 , 22 , 23 , inklusive Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP. , 28 , 29 , 30. På samme måde er en progressiv reduktion af den autofagiske proces observeret hos ældre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , efter et tab af muskelmasse (henvist til sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og i myofiber overlevelse 38 .
Et tæt samarbejde mellem autophagy og regenerativ potentialet af skeletsmuskler forventes ved en undersøgelse fra Wagers laboratorium, hvilket viste at en kaloriebegrænsning forbedrer MuSC-tilgængelighed og aktivitet 39 . Dette nrBlev yderligere understøttet af den nylige bemærkning, at Foxo3-Notch-aksen aktiverer den autofagiske proces under selvfornyelse 40 og MuSC-overgangen fra det hvile til proliferationstilstanden 41 . Disse data er i overensstemmelse med den progressive reduktion af basal autofagi fra unge til gamle og geriatriske MuSC'er i forbindelse med den numeriske og funktionelle nedgang af MuSCs under aldring 42 .
I et nyligt dokument viste vi et nært forhold mellem autophagy og kompenserende muskelregeneration, som skelner mellem de tidlige stadier af DMD-progression. Følgelig observerede vi en reduceret autofagisk flux ved senere stadier af sygdomsprogression, når muskelregenerering er kompromitteret, og fibrotisk vævsaflejring forekommer. Trængende viste vi, at autophagy i regenereringsbetingelser aktiveres i MuSC'er, og at den modulerende autofagiske proces påvirker MuSC-aktivering og fuNctionality 30 .
Samlet set fremhæver disse data, at det er uopsætteligt at undersøge den autofagiske proces i MuSCs under muskelregenerering under normale og patologiske forhold og i hele levetiden. Her tilvejebringer vi en protokol til overvågning af den autofagiske proces i MuSCs i muskelregenerative betingelser ved at udføre in situ immunfarvning for mikrotubulærassocieret protein 1A / 1B-let kæde 3 (LC3), en markør for autophagy 43 og MyoD, en markør for Myogen stamme, i muskelvævssektioner fra kontrol og skadede mus. Den rapporterede metode giver mulighed for at overvåge den autofagiske proces i et specifikt cellerum, MuSC, som spiller en central rolle i orkestrerende muskelregenerering.
Denne protokol beskriver, hvordan man overvåger autofagi i skeletmuskelstamceller under kompenserende muskelregenerering. Flere antistoffer til co-farvning af LC3 og MyoD blev forsøgt, og dem der arbejder i musevævsafsnit og skaber vellykkede resultater, er anført her (se Materialebord ). Permeabiliseringen med methanol (se trin 3.2.2) anbefales stærkt til succesfuld farvning.
Begrænsningen af denne protokol er forbundet med musens indre variabilitet, hvilk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev understøttet af NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT til LL
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |