In situ Immunofluorescerende farvning af autophagy i muskelstamceller
Summary
Aktiv autofagi er forbundet med produktiv muskelregenerering, hvilket er afgørende for aktivering af muskelstamceller (MuSC). Her tilvejebringer vi en protokol til in situ detektion af LC3, en autophagy markør i MyoD-positive MuSCs af muskelvævssektioner fra kontrol og skadede mus.
Abstract
Øget bevis peger på autofag som en afgørende reguleringsproces for at bevare vævshomostase. Det er kendt, at autofagi er involveret i udvikling af skeletmuskel og regenerering, og den autofagiske proces er blevet beskrevet i flere muskulære patologier og aldersrelaterede muskelforstyrrelser. En nyligt beskrevet blok af den autofagiske proces, der korrelerer med den funktionelle udtømning af satellitceller under muskelreparation, understøtter forestillingen om, at aktiv autofagi er koblet til produktiv muskelregenerering. Disse data afdækker den afgørende rolle autofagi i satellitcelleaktivering under muskelregenerering i både normale og patologiske tilstande, såsom muskeldystrofier. Her tilvejebringer vi en protokol til overvågning af autophagic-processen i voksen muskelstamceller (MuSC) under muskelregenerative betingelser. Denne protokol beskriver opsætningsmetoden til at udføre in situ immunofluorescensbilleddannelse af LC3, en aUtophagy markør og MyoD, en myogen linie markør, i muskelvæv sektioner fra kontrol og skadede mus. Den rapporterede metode muliggør overvågning af den autofagiske proces i et specifikt cellerum, MuSC-rummet, som spiller en central rolle i orkestrerende muskelregenerering.
Introduction
Skeletmuskleregenerering er resultatet af interaktionen mellem voksne stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) og andre celletyper, der er involveret i den regenerative proces. Muskel homeostase og funktionalitet opretholdes af de kombinerede signaler, der stammer fra muskel niche og systemiske tegn 1 , 2 . Gennem hele levetiden er der rapporteret om ændringer i MuSC-funktionaliteten, muskelnichen og de systemiske signaler, hvilket resulterer i tilbagegang i funktionelle kapaciteter hos ældre 3 . MuSCs er sat i en niche under basal lamina og ved muskelskade aktiveres for at reparere beskadigede muskler 4 , 5 . For at sikre et produktivt regenerativt respons er det afgørende, at MuSCs koordinerer forskellige processer, der er nødvendige for udgangen fra quiescence, selvfornyelsen og den proliferative ekspansionsstadium fulgtVed myogen differentiering 6 . Hos ældre og muskulære kroniske sygdomme er alle disse funktioner kompromitteret, hvilket fører til ændret muskelfunktionalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Makroautofagi (herefter omtalt som autofagi) fremkommer som en afgørende biologisk proces, der er afgørende for at bevare vævshomostase 14 . Den autophagiske proces omslutter menneskehandel mekanismer, hvor dele af cytoplasma, organeller og proteiner opsluges i vesikler, der til sidst nedbrydes via lysosomvejen, fremmer fjernelsen af toksiske molekyler og genanvendelse af makromolcules. Dette giver energirige forbindelser til understøttelse af celle- og vævsadaptation under stress eller andre ugunstige tilstande 15 , 16 . Sammen med sin celleoverlevelsesaktivitet kan autophagi også fungere som en celledødsinducer, afhængig af cellevævskontekst ( fx normalt versus kræftvæv) og typen af stress-stimulus 17 , 18 .
Nylige beviser tyder på, at autofagi er nødvendig for at opretholde muskelmasse og myofiberintegritet 19 , 20 og er blevet rapporteret at være svækket i forskellige muskeldystrofier 21 , 22 , 23 , inklusive Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP. , 28 , 29 , 30. På samme måde er en progressiv reduktion af den autofagiske proces observeret hos ældre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , efter et tab af muskelmasse (henvist til sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og i myofiber overlevelse 38 .
Et tæt samarbejde mellem autophagy og regenerativ potentialet af skeletsmuskler forventes ved en undersøgelse fra Wagers laboratorium, hvilket viste at en kaloriebegrænsning forbedrer MuSC-tilgængelighed og aktivitet 39 . Dette nrBlev yderligere understøttet af den nylige bemærkning, at Foxo3-Notch-aksen aktiverer den autofagiske proces under selvfornyelse 40 og MuSC-overgangen fra det hvile til proliferationstilstanden 41 . Disse data er i overensstemmelse med den progressive reduktion af basal autofagi fra unge til gamle og geriatriske MuSC'er i forbindelse med den numeriske og funktionelle nedgang af MuSCs under aldring 42 .
I et nyligt dokument viste vi et nært forhold mellem autophagy og kompenserende muskelregeneration, som skelner mellem de tidlige stadier af DMD-progression. Følgelig observerede vi en reduceret autofagisk flux ved senere stadier af sygdomsprogression, når muskelregenerering er kompromitteret, og fibrotisk vævsaflejring forekommer. Trængende viste vi, at autophagy i regenereringsbetingelser aktiveres i MuSC'er, og at den modulerende autofagiske proces påvirker MuSC-aktivering og fuNctionality 30 .
Samlet set fremhæver disse data, at det er uopsætteligt at undersøge den autofagiske proces i MuSCs under muskelregenerering under normale og patologiske forhold og i hele levetiden. Her tilvejebringer vi en protokol til overvågning af den autofagiske proces i MuSCs i muskelregenerative betingelser ved at udføre in situ immunfarvning for mikrotubulærassocieret protein 1A / 1B-let kæde 3 (LC3), en markør for autophagy 43 og MyoD, en markør for Myogen stamme, i muskelvævssektioner fra kontrol og skadede mus. Den rapporterede metode giver mulighed for at overvåge den autofagiske proces i et specifikt cellerum, MuSC, som spiller en central rolle i orkestrerende muskelregenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man overvåger autofagi i skeletmuskelstamceller under kompenserende muskelregenerering. Flere antistoffer til co-farvning af LC3 og MyoD blev forsøgt, og dem der arbejder i musevævsafsnit og skaber vellykkede resultater, er anført her (se Materialebord ). Permeabiliseringen med methanol (se trin 3.2.2) anbefales stærkt til succesfuld farvning.
Begrænsningen af denne protokol er forbundet med musens indre variabilitet, hvilk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev understøttet af NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT til LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Referências
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
