मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं में स्वस्थता के सिटू इम्युनोफ्लोरोइसेंट स्टाइनिंग में
Summary
सक्रिय भोजी उत्पादक मांसपेशी पुनर्जनन के साथ जुड़ा हुआ है, जो स्नायु स्टेम सेल (एमईएससी) सक्रियण के लिए आवश्यक है। यहां, हम नियंत्रण और घायल चूहों से मांसपेशियों के ऊतक वर्गों के माओड-पॉजिटिव मुस्कलों में एक भोजी मार्कर LC3 के स्वस्थानी पहचान में एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
बढ़ती साक्ष्य टिशू होमोस्टेसिस को संरक्षित करने के लिए एक महत्वपूर्ण नियामक प्रक्रिया के रूप में भोजी को इंगित करता है यह ज्ञात है कि भोजी कंकाल की मांसपेशियों के विकास और पुनर्जनन में शामिल है, और कई मांसपेशियों के विकृतियों और उम्र से संबंधित मांसपेशी विकारों में स्वस्थ प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। मांसपेशियों की मरम्मत के दौरान उपग्रह कोशिकाओं के कार्यात्मक थकावट के साथ सहभागिता वाली स्वस्थ प्रक्रिया की एक हालिया वर्णित अवधारणा यह दर्शाती है कि सक्रिय भोजी उत्पादक मांसपेशी पुनर्जनन के साथ युग्मित है। इन आंकडों में सामान्य और रोग दोनों की स्थिति में मांसपेशियों के उत्थान के दौरान उपग्रह सेल सक्रियण में भोजी की महत्वपूर्ण भूमिका को उजागर किया जाता है, जैसे कि पेशी डाइस्ट्रोफी यहां, हम मांसपेशी पुनर्योजी परिस्थितियों के दौरान प्रौढ़ स्नायु स्टेम सेल (एमयूसीसी) कम्पार्टमेंट में आक्सीफैजिक प्रक्रिया की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल एलसी 3 के सीटू इम्युनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए सेटअप पद्धति का वर्णन करता है, ए एकयूटोफैजी मार्कर, और मायऑड, एक मैयोजेनिक वंश मार्कर, नियंत्रण से मांसपेशियों के ऊतक वर्गों और घायल चूहों में। रिपोर्ट की गई पद्धति में एक विशिष्ट सेल डिब्बे, म्यूसिक कम्पार्टमेंट में आंकात्मक प्रक्रिया की निगरानी के लिए अनुमति दी जाती है, जो मांसपेशियों के उत्थान के आयोजन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन वयस्क स्टेम कोशिकाओं (स्नायु उपग्रह कोशिकाओं, मुकाबले) और अन्य कोशिका प्रकारों के बीच संपर्क का परिणाम है जो पुनर्योजी प्रक्रिया में शामिल हैं। स्नायु होमोस्टैसिस और कार्यक्षमता मांसपेशियों के आला और प्रणालीगत संकेत 1 , 2 से उत्पन्न होने वाले संयुक्त सिग्नल द्वारा बनाए जाते हैं। जीवनकाल के दौरान, म्यूएससी की कार्यक्षमता में परिवर्तन, मांसपेशियों की जगह और प्रणालीगत संकेतों की सूचना दी गई है, जिससे बुजुर्गों में कार्यात्मक क्षमता में गिरावट आई है। मुख्यालयों को बेसल लैमीना के नीचे एक जगह में स्थापित किया गया है और, मांसपेशियों की चोट के कारण, क्षतिग्रस्त मांसपेशियों की मरम्मत के लिए सक्रिय कर रहे हैं 4 , 5 । एक उत्पादक पुनर्योजी प्रतिक्रिया को सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि मुकाबला क्विज़सेंस से बाहर निकलने के लिए आवश्यक विभिन्न प्रक्रियाओं का समन्वय करता है, स्व-नवीकरण, और प्रजनन विस्तारित चरण का पालन किया जाता हैMyogenic भेदभाव द्वारा 6 बुजुर्ग और पेशी संबंधी बीमारियों में, इन सभी कार्यों से समझौता किया जाता है, जिससे बदलती पेशी की कार्यक्षमता 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 हो सकती है ।
मैक्रॉटोफॉजी (बाद में आंतों के रूप में उल्लिखित) ऊतक होमोस्टेसिस 14 को संरक्षित करने के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया के रूप में उभर रहा है। स्वाभाविक प्रक्रिया तस्करी तंत्रों को घेरती है, जहां कोशिकालोग, ऑर्गेनेल और प्रोटीन के अंश को vesicles में घिरा हुआ है जो अंततः लाइसोसोम मार्ग से अपमानित हो जाता है, विषाक्त अणुओं को हटाने और मैक्रोमोल के रीसाइक्लिंग को बढ़ावा देता है।cules। यह तनाव या अन्य प्रतिकूल परिस्थितियों में सेल और ऊतक अनुकूलन का समर्थन करने के लिए ऊर्जा-समृद्ध यौगिक प्रदान करता है 15 , 16 । कोशिका-टिशू संदर्भ ( जैसे, सामान्य बनाम कैंसर के ऊतकों) और तनाव उत्तेजनाओं के प्रकार 17 , 18 के आधार पर, कोशिका-अस्तित्व की गतिविधि के साथ, भोजी कोशिका-मृत्यु के रूप में काम कर सकते हैं।
हाल के साक्ष्य इंगित करता है कि मांसपेशियों और माईओफ़िएयर अखंडता 1 9 , 20 को बनाए रखने के लिए भोजी की आवश्यकता होती है और 24 , 25 , 26 , 27 , ड्यूसेन मस्कुलर डिस्ट्रोफी (डीएमडी) 24 , 25 , 26 , 27 सहित विभिन्न मांसपेशी डिस्ट्रोफी 21 , 22 , 23 में खराब होने की सूचना दी गई है। </suपी , 28 , 2 9 , 30। इसी तरह, मांसपेशियों के नुकसान के बाद 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , बुजुर्गों में स्वाभाविक प्रक्रिया में प्रगतिशील कमी देखी गई है (जिसे सैर्कोपेनिया कहा जाता है) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , और माय्योफिर में जीवित रहने वाले 38
कंकाल की मांसपेशियों के स्वस्थ और पुनर्योजी क्षमता के बीच घनिष्ठ सम्बन्ध का अनुमान Wagers की प्रयोगशाला से किया गया था, जिसमें पता चलता है कि एक कैलोरी प्रतिबंध मुशाव की उपलब्धता और गतिविधि को बढ़ाता है। यह नहींहाल के अवलोकन के अनुसार, आगे की आशंका को समर्थन दिया गया था कि फॉक्सओ 3-नोटिस अक्ष स्व-नवीकरण 40 और म्यूसिक के संक्रमण के दौरान मौत से उगने वाले राज्य 41 तक आत्मसात करने वाली प्रक्रिया को सक्रिय करता है। ये डेटा उम्र के 42 के दौरान मुख्यालयों की संख्यात्मक और कार्यात्मक गिरावट के साथ-साथ, युवाओं से पुरानी और वृहद मुकाबले के आधारभूत फार्मेजी के प्रगतिशील घटने से सहमत हैं।
हाल ही के एक पेपर में, हमने फार्मेजी और प्रतिपूरक मांसपेशी पुनर्जनन के बीच घनिष्ठ संबंध का प्रदर्शन किया जो डीएमडी की प्रगति के शुरुआती चरणों को अलग करता है। तदनुसार, हम बीमारी की प्रगति के बाद के चरणों में एक कम स्वस्थ फ्लक्स देख चुके हैं, जब मांसपेशियों के पुनर्जन्म का समझौता किया जाता है और फाइब्रोटिक टिशू बयान होता है। दिलचस्प है, हमने दिखाया कि, परिस्थितियों में पुनर्जीवित होने पर, मुकाबला मुशाफिरों में सक्रिय हो जाता है और यह स्वप्रभावपूर्ण प्रक्रिया को म्यूसिक सक्रियण और फ़्यूNctionality 30
कुल मिलाकर, ये आंकड़े सामान्य और रोगजनक परिस्थितियों में और पूरे जीवनकाल में मांसपेशियों के उत्थान के दौरान मुसब्बर में स्वाभाविक प्रक्रिया का पता लगाने के लिए जरूरी बात को उजागर करते हैं। यहां, हम माइक्रोटुबूल से जुड़े प्रोटीन 1 ए / 1 बी-लाइट चेन 3 (एलसी 3), ऑटोजीजी 43 के मार्कर, और माओड, के मार्कर के लिए सीट इट्यूनोस्टेन्सींग में पेश करके मांसपेशी पुनर्योजी स्थितियों में एमओसीएस में आक्सीफैजिक प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। मांसपेशी वंश, नियंत्रण से मांसपेशियों के ऊतक वर्गों और घायल चूहों में। रिपोर्ट की गई पद्धति में एक विशिष्ट सेल डिब्बे में ऑक्सीफैजिक प्रक्रिया की निगरानी करने की अनुमति मिलती है, जो कि एमओएससी, जो मांसपेशियों के उत्थान के आयोजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि क्षतिपूर्ति मांसपेशियों के उत्थान के दौरान कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं में भोजी की निगरानी कैसे करें। LC3 और MyoD के सह-धुंधला के लिए कई एंटीबॉडी की कोशिश की गई, और जो माउ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएएमएस AR064873, एपीगेन प्रोजेक्ट पीबी द्वारा समर्थित था। पी 101.001.01 9 / प्रोगेट्टो बांडीएरा एपिगोनेमिका आईएफटी को एलएलएल
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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