Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares
Summary
La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.
Abstract
La creciente evidencia apunta a la autofagia como un proceso regulador crucial para preservar la homeostasis de los tejidos. Se sabe que la autofagia está implicada en el desarrollo y regeneración del músculo esquelético, y el proceso autofágico ha sido descrito en varias patologías musculares y trastornos musculares relacionados con la edad. Un bloque recientemente descrito del proceso autofágico que se correlaciona con el agotamiento funcional de las células satélites durante la reparación muscular apoya la noción de que la autofagia activa se combina con la regeneración muscular productiva. Estos datos revelan el papel crucial de la autofagia en la activación de las células satélite durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas, como las distrofias musculares. Aquí, proporcionamos un protocolo para supervisar el proceso autofágico en el adulto Muscle Stem Cell (MuSC) compartimento durante el músculo regenerativas condiciones. Este protocolo describe la metodología de configuración para realizar imágenes de inmunofluorescencia in situ de LC3, aMarcador de utofagia y MyoD, un marcador de linaje miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones controlados y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el compartimiento MuSC, que desempeña un papel central en la orquestación de la regeneración muscular.
Introduction
La regeneración del músculo esquelético es el resultado de la interacción entre las células madre adultas (Muscle Satellite Cells, MuSCs) y otros tipos de células que intervienen en el proceso regenerativo. La homeostasis muscular y la funcionalidad se mantienen por las señales combinadas que surgen del nicho muscular y las señales sistémicas 1 , 2 . A lo largo de la vida, se han reportado cambios en la funcionalidad MuSC, el nicho muscular y las señales sistémicas, lo que conduce a la disminución de las capacidades funcionales en los ancianos 3 . MuSCs se establecen en un nicho por debajo de la lámina basal y, a la lesión muscular, se activan para reparar los músculos dañados [ 4 , 5] . Para asegurar una respuesta regenerativa productiva, es crucial que las MuSCs coordinen los diferentes procesos necesarios para que la salida de la quiescencia, la auto-renovación y la etapa de expansión proliferativa siganPor la diferenciación miogénica 6 . En los ancianos y en las enfermedades crónicas musculares, todas estas funciones están comprometidas, lo que conduce a la alteración de la funcionalidad muscular 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
La macroautofagia (denominada en lo sucesivo autofagia) está emergiendo como un proceso biológico crucial esencial para preservar la homeostasis tisular 14 . El proceso autofágico incluye mecanismos de tráfico, donde porciones de citoplasma, orgánulos y proteínas se envuelven en vesículas que eventualmente se degradan a través de la vía lisosoma, promoviendo la eliminación de moléculas tóxicas y el reciclaje de macromolCulos Esto proporciona compuestos ricos en energía para apoyar la adaptación de células y tejidos bajo estrés u otras condiciones adversas 15 , 16 . Junto con su actividad de supervivencia celular, la autofagia también puede funcionar como un inductor de la muerte celular, dependiendo del contexto del tejido celular ( por ejemplo, tejido normal frente al cáncer) y el tipo de estímulo de estrés 17 , 18 .
La evidencia reciente indica que la autofagia es necesaria para mantener la masa muscular y la integridad de la miofibra 19 , 20 y se ha reportado que está alterada en diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluyendo la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP> , 28 , 29 , 30. De igual modo, se ha observado una reducción progresiva del proceso autofágico en los ancianos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , después de una pérdida de masa muscular (denominada sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , y en la supervivencia de miofibras 38 .
Una relación estrecha entre la autofagia y el potencial regenerativo de los músculos esqueléticos fue anticipada por un estudio del laboratorio de Wagers, que mostró que una restricción de calorías mejora la disponibilidad y la actividad de MuSC [ 39] . Esto noLa reciente observación de que el eje Foxo3-Notch activa el proceso autofágico durante la auto-renovación [ 40] y la transición de MuSC desde el estado quiescente al estado de proliferación [ 41] . Estos datos concuerdan con la reducción progresiva de la autofagia basal de jóvenes a ancianos y geriátricos MuSCs, en asociación con el descenso numérico y funcional de MuSCs durante el envejecimiento [ 42] .
En un artículo reciente, demostró una estrecha relación entre la autofagia y la regeneración muscular compensatoria que distingue las primeras etapas de la progresión de la DMD. En consecuencia, se observó una reducción del flujo autofágico en etapas posteriores de la progresión de la enfermedad, cuando la regeneración muscular se ve comprometida y deposición de tejido fibrótico se produce. Curiosamente, se demostró que, en condiciones de regeneración, la autofagia se activa en MuSCs y que la modulación del proceso autofágico impacta la activación MuSC y fuNcionalidad 30 .
En conjunto, estos datos ponen de relieve la urgencia de explorar el proceso autofágico en MuSCs durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas ya lo largo de la vida. En este sentido, proporcionamos un protocolo para monitorear el proceso autofágico en MuSCs en condiciones de regeneración muscular mediante la realización in situ de inmunotinción para los microtúbulos asociados a la proteína 1A / 1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador de autofagia [ 43] , y MyoD, un marcador de Miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones control y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el MuSC, que desempeña un papel clave en la orquestación de la regeneración muscular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe cómo monitorear la autofagia en las células madre del músculo esquelético durante la regeneración muscular compensatoria. Varios anticuerpos para la co-tinción de LC3 y MyoD fueron probados, y los que trabajan en las secciones de tejido de ratón y crear resultados exitosos se enumeran aquí (ver Tabla de Materiales ). La permeabilización con metanol (ver paso 3.2.2) es altamente recomendada para la tinción exitosa.
La limitación de est…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIAMS AR064873, Epigen Proyecto PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Referências
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
