Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод
Summary
Эта рукопись описывает метод для визуализации и количественно локализованное события субцеллюлярные отсеков. Подход, предложенный в этой рукописи требует базовой конфокальный тепловизионные системы и реагенты и быстрое и экономически эффективным.
Abstract
Механизмы, регулирующие перевод мРНК участвуют в различных биологических процессах, например зародышевой линии развития, дифференцировки клеток и органогенез, а также в нескольких заболеваний. Многочисленные публикации убедительно показали, что конкретные механизмы плотно регулировать перевод мРНК. Повышенный интерес в перевод индуцированной регуляции экспрессии белков привело к разработке новых методов изучать и следовать de novo белка синтеза в cellulo. Однако большинство этих методов являются сложными, что делает их дорогостоящей и зачастую ограничивает количество мРНК-мишеней, которые могут быть изучены. Эта рукопись предлагает метод, который требует только основные реагенты и конфокальный флуоресценции тепловизионные системы измерения и визуализировать изменения в переводе мРНК, которые происходят в любой ячейке линии при различных условиях. Этот метод был недавно используется локализованный перевод в внутриклеточных структур адэрентных клеток за короткий период времени, таким образом предлагая возможность визуализации de novo перевода короткий период во время различных биологических процессы или проверка изменений переводческая деятельность в ответ на конкретные стимулы.
Introduction
Правила перевода различных клеточных функций побудило многие исследовательские группы для разработки новых инструментов и методов для определения субцеллюлярные локализации перевод мРНК и регулируемых белка синтез1,2 ,3,4. Эти последние технологические достижения позволяют добиться более глубокого понимания механизмов, связанных с переводом upregulation или репрессий конкретные мРНК в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастазов5 ,6,,78. Однако большинство из этих методов требуют дорогих или опасных реагентов и специального оборудования, которые не могут быть доступны для большинства лабораторий. Таким образом был разработан эффективный метод для быстрой оценки перевод событий специально обойти эти потенциальные проблемы. Этот метод обнаруживает острый трансляционная модуляций, которые происходят во время конкретных клеточных процессов, а также позволяет для локализации перевода с помощью конфокальной микроскопии.
Описанные здесь методы были использованы для мониторинга локализованный перевод в течение субцеллюлярные отсеков под названием распространяя возбуждение центров (SIC)5. Шиц являются переходных структур, обнаруженных в сеяный клеток, которые локализуются на вершине зарождающейся адгезии комплексов. Хотя Шиц и адгезии комплексы отличаются друг от друга, их судьбы тесно связаны. Действительно SICs известны постепенно исчезают после фокуса адгезии комплекс созревания в сайт адгезии на начальном этапе адгезии. Мы обнаружили, что RNA-связывая протеинов, известный специально контролировать мРНК перевода (например, Sam68, FMRP и G3BP1) и polyadenylated, РНК обогатились в рамках этих структур5. С помощью методов, описанных здесь, мы показали, что регулирование SIC-связанные мРНК, перевод действует как КПП позволяет посеян клетки для консолидации клеточной адгезии. Этот метод, основанный на puromycin включения, можно считать адаптированную версию поверхности зондирования перевод пробирного (закат). Первоначально разработанный для измерения скорости синтеза глобального белка с помощью радиоактивно обозначенные аминокислоты, протеин puromycilation предлагает эффективный способ визуализации белка de novo синтеза9. Этот метод полагается на внутренние поведение puromycin, антибиотик, который блокирует перевод через прекращение преждевременной цепи в рибосома10. Действительно puromycin структурно аналогичен тирозил тРНК, который позволяет для включения в удлинения пептидные цепи через образование пептидных связей. Однако puromycin привязки к растущей цепи пептида предотвращает формируется с следующей аминоацил тРНК, так как puromycin не hydrolysable Амид облигаций вместо hydrolysable Эстер Бонд в tRNAs нового Бонда пептид. Таким образом включение puromycin в удлинения полипептиды приводит к преждевременной выпуска многочисленных усеченная puromycilated полипептиды, соответствующий активно переводится мРНК9,11,12 .
С помощью этого метода, можно было оценить активный перевод в течение короткого времени вдова (например, 5 минут) во время клеточной адгезии с использованием специфического антитела, направленные против puromycin на клетки, которые были дополнены антибиотика для периодов 5-мин в точках в разное время в ходе процесса адгезии клеток5. Точность этот assay полагается на весьма специфические антитела, направленные против puromycilated группу. Immunofluorescent обнаружения puromycilated полипептида обеспечивает общий субцеллюлярные передел недавно переведенные мРНК, которые также могут быть количественно с большой точностью с помощью конфокальной систем тепловидения.
Следовательно этот метод предлагает соответствующую опцию для большого числа лабораторий, изучая трансляционная регулирующих механизмов, участвующих в процессах таких нейронов грануляции6,13,14, 15, morphogen мРНК локализации и перевода во время развития16,17. Это также хорошо подходит для изучения локализованных или разобщенным перевод во время быстрого биологических событий, например миграции клеток, адгезии или вторжения, или просто оценить медикаментозного лечения, которые могли бы побудить поступательные изменения5, 7 , 18. в целом, этот метод позволяет для визуализации событий локализованных или контролируемых перевод в быстрый, точный и экономически эффективным способом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Последние технологические достижения позволили лучше понять механизмы, участвующие в трансляционной upregulation или репрессии в отношении конкретных mRNAs в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастаз. Экономически эффективные методологии, опис?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Рашид Mazroui (Университет Лаваля, Квебек, Канада) для критических чтении рукописи. Мы благодарим Imaging группа клеток научно-исследовательского центра для их технической помощи. М.-É. Хуот является младший 1 исследования ученый Fonds de Recherche дю Квебек-здоровью (FRQ-S). Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (номер КНИИЗ, СС-286437 к. м.-É гранта. Хуот).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
Referências
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
