Улучшение приложения высокомолекулярного декстрана биотинилированным Амин Thalamocortical проекции трассировки в крыса
Summary
Здесь мы представляем изысканные протокол эффективно раскрыть биотинилированным декстрана Амин (BDA) маркировки с флуоресцентных окрашивания метода через взаимные нейронные пути. Это подходит для анализа тонкой структуры из BDA маркировки и отличает его от других нервных элементов под конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.
Abstract
Биотинилированным высокомолекулярного декстрана Амин (BDA) был использован как трассировщик высокочувствительный нейроанатомический на протяжении многих десятилетий. Поскольку качество его маркировки пострадал от различных факторов, здесь, мы предлагаем изысканный протокол для применения высокой молекулярной массой BDA для изучения оптимальных нейронных маркировки в центральной нервной системе. После стереотаксической инъекции АРП в вентральной задне ядро таламуса крыс через деликатные стеклянные пипетки (ВПМ) BDA витражи с флуоресцентные стрептавидина Alexa (AF) 594 и counterstained с флуоресцентные Ниссль пятно AF500/525. На фоне зеленых Ниссль окрашивание красный BDA маркировки, включая нейрональных клеток органов и аксональной терминалы, более отчетливо проявилось в соматосенсорной коры. Кроме того, двойной флуоресцентные пятная для BDA и кальция связывания белка Парвальбумин (PV) была проведена соблюдать соотношение BDA маркировки и PV-позитивных интернейронов корковых целевой, предоставляя возможность для изучения местных нейронных схемы и их химических характеристик. Таким образом этот изысканный метод подходит не только для визуализации высокого качества нейронных маркировки с высокой молекулярной массой BDA через взаимные нервные пути между таламус и коры головного мозга, но также позволит одновременной демонстрации другие нейронных маркеры с флуоресцентные гистохимии или иммунохимии.
Introduction
Высокомолекулярный BDA (10,000 молекулярный вес), высокочувствительный трассировщика, была использована для отслеживания нервные пути в центральной нервной системе для более чем 20 лет1. Хотя использование BDA является общей нейронных тракта, отслеживание техники, качество BDA маркировки могут быть затронуты в животных различных факторов1,2,3. Наши недавнее исследование показало, что оптимальная структура BDA маркировки не только связанные с надлежащей впрыск выживания время, но также коррелирует с окрашивание метод4. До сих пор, обычных авидин биотин пероксидаза комплекс (ABC), стрептавидина флуоресцеин Изотиоцианаты и AF594 стрептавидина пятная методы были использованы для выявления, маркировки АРП в предыдущих исследований2,3, 4,5. В сравнении флуоресцентный окрашивания для BDA могут легко выполняться.
Для того, чтобы распространить применение высокой молекулярной массой BDA, изысканный протокол был введен в настоящем исследовании. После инъекции АРП в VPM таламуса в мозге крыс BDA маркировки было выявлено регулярный метод окрашивания стандартной ABC, а также двойной флуоресцентные окрашивание, которая была проведена для наблюдения корреляции BDA маркировки и основные нервных элементов или интернейронов корковых целевой стрептавидина AF594 и флуоресцентные Ниссль гистохимии или PV-Иммунохимия, соответственно. Через взаимное нервные пути между ВПМ и первичной соматосенсорной коры (S1)6,7,8мы сосредоточили наши наблюдения на BDA маркировки в thalamocortical прогнозам аксонов и corticothalamic СОСМ прогнозируемые ячейки в строке S1. Этот процесс мы должны обеспечить не только подробный протокол для получения высокого качества нейронных маркировки с высокой молекулярной массой BDA, но и изысканный протокол на сочетание люминесцентные маркировки BDA и другие флуоресцентные нейронных маркеры с гистохимии или иммунохимии. Этот подход предпочтительнее изучить местные нейронных цепей и их химических характеристик под Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выбор надлежащего трассирующими является важным шагом для успешной нейронных трассировки эксперимента. В семье BDA, высокой молекулярной массой BDA (10,000 молекулярный вес) было рекомендовано преференциально перевозиться через антероградная нейронные пути в отличие от низкомолекулярных…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Национальный фонд Китая естественных наук (проект кодекса № 81373557, № 81403327).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
Referências
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O’Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neurociência. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
