Mejorar la aplicación de la amina de biotinilado dextrano de alto peso Molecular para la proyección de talamocorticales remontar en la rata
Summary
Aquí, presentamos un protocolo refinado para revelar con eficacia biotinilado amina de dextrano (BDA) etiquetado con un fluorescente tinción a través de una vía neural recíproca. Es conveniente para el análisis de la estructura fina de la BDA de etiquetado y distinguirlo de otros elementos neurales en un láser confocal de barrido microscopio.
Abstract
Amina de alto peso molecular biotinilado dextrano (BDA) se ha utilizado como trazador neuroanatomical altamente sensible para muchas décadas. Puesto que la calidad de su etiqueta fue afectada por diversos factores, aquí ofrecemos un refinado protocolo para la aplicación de alto peso molecular BDA para el estudio de etiquetado neuronal óptima en el sistema nervioso central. Después de la inyección estereotáxica de BDA en el núcleo ventral posteromedial (VPM) del tálamo en la rata a través de una pipeta de vidrio delicado, BDA fue manchado con estreptavidina fluorescente-Alexa (AF) 594 y contratinción con tinción de Nissl fluorescente AF500/525. En el fondo del verde de la tinción de Nissl, el etiquetado de BDA rojo, incluyendo cuerpos de células neuronales y terminales axonales, se demostró más claramente en la corteza somatosensorial. Además, doble coloración fluorescente para el BDA y el calcio-que ata la proteína parvalbúmina (PV) se llevó a cabo para observar la correlación de BDA etiquetado y interneurons PV-positivo en el destino cortical, brindando la oportunidad de estudiar al local neural circuitos y sus características químicas. Por lo tanto, este método refinado no sólo es adecuado para la visualización de alta calidad neuronal etiquetado con peso molecular alto BDA a través de vías neuronales recíprocos entre el tálamo y la corteza cerebral, pero también permitirá la demostración simultánea de otros marcadores neuronales con histoquímica fluorescente o inmunoquímica.
Introduction
Alto peso molecular BDA (peso molecular 10.000), un palpador muy sensible, se ha utilizado para rastrear las vías nerviosas en sistema nervioso central para más de 20 años1. Aunque el uso de la AOE es un tracto neuronal comun técnica de rastreo, la calidad de la BDA de etiquetado puede ser afectada por varios factores1,2,3en animales. Nuestro reciente estudio indica que la estructura óptima de BDA etiquetado no sólo asociada con un tiempo de supervivencia después de la inyección adecuada, sino también correlacionan con la tinción del método4. Hasta ahora, convencional complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC), estreptavidina-fluoresceína isotiocianato y estreptavidina-AF594 métodos de tinción fueron utilizados para revelar el etiquetado BDA en anteriores estudios2,3, 4,5. En comparación, tinción fluorescente para BDA puede realizar fácilmente.
Con el fin de ampliar la aplicación de alto peso molecular BDA, un refinado protocolo fue introducido en el presente estudio. Después de la inyección de BDA en el VPM del tálamo en el cerebro de la rata, BDA etiquetado fue revelado por el método regular de tinción estándar de ABC así como manchando de doble fluorescente, que se llevó a cabo para observar la correlación de BDA etiquetado y básico elementos neurales o interneuronas en el destino cortical con estreptavidina AF594 e histoquímica fluorescente de Nissl o biopsia de PV, respectivamente. A través de las vías neuronales recíprocas entre el VPM y la corteza somatosensorial primaria (S1)6,7,8, centramos nuestra observación en BDA etiquetado talamocorticales proyectadas axones y corticothalamic Soma celular proyectada en el S1. Por este proceso, espera que no sólo un protocolo detallado para la obtención de la alta calidad de etiquetado nervios con alto peso molecular BDA, sino también un protocolo de refinado en la combinación de fluorescentes BDA etiquetado y otros marcadores neuronales fluorescentes con histoquímica o inmunoquímica. Este enfoque es preferible para el estudio de los circuitos neuronales locales y sus características químicas bajo un láser confocal de barrido microscopía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seleccionar un palpador apropiado es un paso crítico para un experimento de éxito seguimiento neural. En la familia de la BDA, alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular) se recomienda preferentemente transportarse a través de la vía neural anterograde en contraste con bajo peso molecular BDA (3.000 peso molecular)2,3 , 11 , 12 , 13. sin embargo, mucho…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (proyecto Código Nº 81373557, Nº 81403327).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
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