Förbättra tillämpningen av hög molekylvikt biotinylerade Dextran Amine för Thalamocortical projektion spåring i råtta
Summary
Här presenterar vi ett raffinerat protokoll för att effektivt avslöja biotinylerade dextran amine (BDA) märkning med en fluorescerande färgning metoden genom ett ömsesidigt neural pathway. Den är lämplig för att analysera i fina struktur av BDA märkning och särskilja det från andra neurala element under en confocal laser skanning Mikroskop.
Abstract
Ultrahög molekylvikt biotinylerade dextran amine (BDA) har använts som mycket känsliga neuroanatomiska spårämne för många årtionden. Eftersom kvaliteten på dess märkning påverkades av olika faktorer, här, ger vi en raffinerad protokollet för tillämpning av hög molekylvikt BDA för att studera optimal neurala märkning i centrala nervsystemet. Efter stereotaktisk injektion av BDA i ventrala posteromedial kärnan (VPM) i thalamus i råtta genom ömtåliga glas pipett, var BDA fläckade av fluorescerande streptividin-Alexa (AF) 594 och counterstained med fluorescerande Nissl fläck AF500/525. På bakgrund av gröna Nissl färgning, visades röda BDA märkning, inklusive neuronala cell organ och axonal terminaler, mer tydligt i somatosensoriska cortex. Dessutom dubbla fluorescerande färgning för BDA och den kalcium-bindande protein parvalbumin (PV) genomfördes för att iaktta korrelationen av BDA etiketterings- och PV-positiv interneuroner i kortikala målet, som ger möjlighet att studera lokalen neurala kretsar och deras kemiska egenskaper. Således, raffinerade metoden passar inte bara för att visualisera hög kvalitet neurala märkning med hög molekylvikt BDA genom ömsesidiga nervbanor mellan thalamus och hjärnbarken, men också tillåter samtidiga demonstrationen av andra neurala markörer med fluorescerande histokemi eller immunkemi.
Introduction
Ultrahög molekylvikt BDA (10.000 molekylvikt), en mycket känslig tracer, har använts för att spåra nervbanor i det centrala nervsystemet för över 20 år1. Även om användningen av BDA är en gemensam neurala tarmkanalen spårning teknik, kan kvaliteten på BDA märkning påverkas hos djur av olika faktorer1,2,3. Vår senaste studie visade att optimal struktur BDA märkning är inte bara förknippas med en ordentlig efter injektion överlevnadstid, men också korrelerade med färgning metod4. Tills nu, konventionella metoden-biotin-peroxidas komplex (ABC), streptividin-fluorescein isotiocyanat och streptividin-AF594 användes färgning metoder för att avslöja BDA märkning i tidigare studier2,3, 4,5. I jämförelse, kan fluorescerande färgning för BDA enkelt utföras.
För att förlänga tillämpningen av hög molekylvikt BDA, infördes ett raffinerat protokoll i den aktuella studien. Efter injektion av BDA till VPM i thalamus i råtthjärna var BDA märkning avslöjade av den vanliga metoden för standard ABC färgning samt dubbel fluorescerande färgning, som genomfördes för att observera korrelationen av BDA märkning och grundläggande neurala element eller interneuroner i kortikala målet med streptividin-AF594 och fluorescerande Nissl histokemi eller PV-immunkemi, respektive. Genom de ömsesidiga nervbanor mellan VPM och den primära somatosensoriska cortex (S1)6,7,8fokuserat vi vår observation på BDA märkning i thalamocortical projiceras axoner och corticothalamic projicerade cell somas i S1. Genom denna process förväntas vi ge inte bara ett detaljerat protokoll för att få den höga kvaliteten på neurala märkning med hög molekylvikt BDA, men också en raffinerad protokollet om kombinationen av fluorescerande BDA märkning och andra fluorescerande neurala markörer med histokemi eller immunkemi. Detta tillvägagångssätt är att föredra att studera de lokala neurala kretsarna och deras kemiska egenskaper enligt en confocal microscopy laserscanning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Välja en ordentlig tracer är ett kritiskt steg för en framgångsrik neurala spårning experiment. I familjen av BDA, hög molekylvikt BDA (10.000 molekylvikt) rekommenderades att transporteras företrädesvis via anterograd neurala vägen i motsats till låg molekylvikt BDA (3.000 molekylvikt)2,3 , 11 , 12 , 13. men många studier föreslog också att hög …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien finansierades av den National Natural Science Foundation Kina (projektet kod nr 81373557, nr 81403327).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
Referências
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O’Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neurociência. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
