Генетически спроектированная мышь Модель спорадического колоректального рака
Summary
Представлен протокол создания генно-инженерной мышиной модели колоректального рака с помощью сегментарной адено-кремовой инфекции и ее наблюдения с помощью колоноскопии высокого разрешения.
Abstract
Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, мышиные модели колоректального рака, основанные на инъекции опухолевых клеток, имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены генно-инженерные мышиные модели; Однако такие модели технически требуются, особенно в больших органах, таких как толстая кишка, в которой желательна только одна опухоль.
В результате была разработана иммунокомпетентная генетически модифицированная мышечная модель колоректального рака, которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Развитие опухоли инициируется хирургической, сегментарной инфекцией дистальной кишки с адено-кре-вирусом у сложных условно мутантных мышей. Опухоли можно легко обнаружить и контролировать с помощью колоноскопии. Мы здесь описываем хирургическую методику сегментарной аденоскопной инфекцииОбодочную кишку, наблюдение за опухолью с помощью колоноскопии высокого разрешения и представление полученных колоректальных опухолей.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) по-прежнему является одной из ведущих причин смертности от рака в западных странах. 1 Хотя прогноз пациентов с ранней стадией заболевания хорош, многие опухоли диагностируются на более поздних стадиях, в которых, несмотря на многочисленные варианты лечения, прогноз ограничен. 2 , 3 , 4 , 5
Большинство современных моделей мыши CRC основаны на имплантации опухолевых клеток, полученных из клеточных линий или опухолей пациентов, на иммунодефицитных мышей. 6 , 7 , 8 Это приводит к локальному и, в зависимости от места инъекции и опухолевым клеткам, используемым для инъекций, иногда метастатическим опухолям. 9 , 10 Однако полученные модели ксенотрансплантатов имеют майоR ограничений. Они должны быть установлены у иммунодефицитных мышей, что устраняет сложное взаимодействие между опухолью и иммунной системой хозяина. Кроме того, поскольку строма опухоли получена из клеток-хозяев, взаимодействие между паренхимой опухоли человека и стромой мыши является дефектной и поэтому не является репрезентативным для данного заболевания. Эти недостатки можно избежать с помощью мышиных клеточных линий для инъекций. Однако доступны только несколько линий клеток CRC мыши и, подобно большинству доступных человеческих CRC-клеточных линий, являются моноклональными и сильно анапластичными. 11 Таким образом, большинство доступных в настоящее время моделей мышей CRC являются очень искусственными и не полностью репрезентативными для болезни человека.
Генетически спроектированные мышиные модели (GEMM) CRC могут избежать этих недостатков, поскольку они показывают истинные мышечные опухоли, которые создаются посредством индукции ключевых мутаций CRC в толстой кишке. 12 , 13 ,14 Это может быть достигнуто путем активации условных (floxed) мутаций зародышевой линии путем рекомбиназы в слизистой оболочке колоректального отдела. В то время как в GEMMs многих других опухолевых сущностей используется зародышевая (индуцибельная) экспрессия cre, обусловленная тканеспецифическими промоторами, зародышевая структура не может использоваться в толстой кишке, так как это приводит к большому количеству аденом во всей толстой кишке, вызывающему смерть при доброкачественной опухолевой нагрузке при Очень молодой возраст. Поэтому в описанной здесь модели используется аденовирусный вектор, выражающий cre, для заражения короткого сегмента толстой кишки. Это приводит к индукции опухолевого генеза в этом сегменте слизистой оболочки в момент времени, определенный исследователем, в результате чего аденомы в конечном итоге прогрессируют до инвазивной и метастатической карциномы. Опухоли являются настоящими мышечными опухолями, растут в интактном микроокружении и поэтому способны имитировать полноту колоректального онкогенеза, включая взаимодействие опухоли-хозяина и метастатический каскад. Эта модельПоэтому является привлекательной платформой для исследований биологии рака и доклинических терапевтических испытаний.
Основным недостатком генно-инженерных моделей мыши CRC является их техническая сложность. Ранее была описана локальная сборка с использованием ректальных аденоцитарных клизмов у мышей, несущих аллергические аллели Apx. Однако, частота, множественность и расположение опухолей кишечника могут быть весьма переменными с помощью этой техники. Таким образом, была разработана методика ограничения адено-крестовой инфекции хирургическим зажимом сегмента, который должен быть индуцирован. 13 Мы изменили эту процедуру, чтобы улучшить благосостояние животных, а также снизить смертность и число возникающих опухолей. С помощью этого протокола все лаборатории, обладающие опытом в малой хирургии грызунов, должны иметь возможность воспроизводить модель и производить опухоли, которые очень воспроизводимы и легко доступны для колоноскопии. В зависимости от условного mUtations, используемых для опухолегенеза, можно наблюдать полный спектр аденомы, инвазивной карциномы и метастазов. Поскольку опухоли расположены в дистальной кишке, серийная эндоскопическая оценка легко возможна в этой модели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя их, как правило, легко создавать и поддерживать, классические мышиные модели CRC, основанные на инъекции клеточной линии, являются искусственными и не в состоянии полностью повторить человеческую болезнь. Как следствие, были разработаны GEMM. Первым CRC GEMM была мышь Apc Min , которая …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа посвящена памяти профессора Морица Коха.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. Fasting of mice: a review. Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).
