JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

В естественных условиях Визуализация Cx3cr1gfp/gfp репортер мышей с спектральные домена оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия

Published: November 11, 2017
doi:
10.3791/55984
, , ,
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research,Bern University Hospital and University of Bern

Summary

Этот протокол описывает как с высоким разрешением изображений методы, такие как спектральной области оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия могут быть использованы в мелких грызунов, с помощью офтальмологических изображений платформы системы, для получения информации о Толщина сетчатки и Микроглии клеток распределения, соответственно.

Abstract

Спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Октябрь) и сканирующий лазер офтальмоскопия (SLO) широко используются в экспериментальной офтальмологии. В настоящем Протоколе, мышей выражая Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) под промоутер Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) были использованы для изображения Микроглии клеток в естественных условиях в сетчатке. Микроглии являются резидентов макрофаги сетчатки и были вовлечены в ряд заболеваний сетчатки1,2,3,4,5,6. Этот протокол обеспечивает детальный подход для поколения сетчатки Б-сканов, с SD-Октябрь и визуализация распределения Микроглии клеток в Cx3cr1gfp/gfp мышей с SLO в естественных условиях, с использованием офтальмологических тепловизионные системы платформы. Протокол может использоваться в нескольких линиях мыши репортер. Однако есть некоторые ограничения для протокола, представленные здесь. Во-первых, SLO и SD-Октябрь, когда используется в режиме с высоким разрешением, сбор данных с высоким разрешением осевой но латеральное разрешение ниже (3,5 мкм и 6 мкм, соответственно). Кроме того уровень внимания и насыщенность в SLO сильно зависит подбор параметров и правильное выравнивание глаза. Кроме того с помощью устройств, предназначенных для человека пациентов в мышей является сложной задачей из-за выше Общая оптическая сила мыши глаза по сравнению с человеческим глазом; Это может привести к боковым увеличение неточности7, который также зависит от масштаба линзы мыши среди других. Однако несмотря на то что положение осевой сканирования зависит от боковых увеличение, осевые измерения SD-Октябрь точной8.

Introduction

В экспериментальной офтальмологии изучения патологии сетчатки обычно оценивается с использованием гистологических методов. Однако требует животных euthanization и может вызвать изменения в фактической свойства ткани гистологии. SD-OCT и SLO обычно используются в клинической офтальмологии для целей диагностики и мониторинга нескольких заболеваний сетчатки, например диабетического макулярного отека9, передней ишемической оптической невропатии10или пигментный ретинит11 . SD-OCT и SLO являются неинвазивные методы, которые создают изображения с высоким разрешением сетчатки, которые визуализируются через расширенные ученик без дальнейшего вмешательства. SD-OCT предоставляет информацию сетчатки структуры и толщина сетчатки, собирая обратного рассеяния данных для создания поперечных изображения сетчатки, в то время как SLO собирает данные флуоресценции для получения стереоскопических изображений высокой контрастностью сетчатки. В настоящее время обе методики все чаще используются в экспериментальной офтальмологии с помощью мелких грызунов12,13,14,15 (или даже данио рерио16,17) и может предоставить оба качественной и количественной информации12,,1718,19,,2021.

Накопление эндогенного флуорофоров как lipofuscins или формирования друз в сетчатке могут быть визуализированы в SLO как auto флуоресцентного сигнала. Эта особенность делает SLO полезен для диагностики и мониторинга заболеваний сетчатки, таких как age-related macular вырождения или пигментный ретинит22,23. В экспериментальной офтальмологии auto флуоресценции изображений (AF) может использоваться для обнаружения типов конкретных клеток в линиях мыши репортер. Например выгодные для визуализации в vivo Микроглии клеток в Нормальная сетчатка и для расследования микроглии/макрофагов мышей гетерозиготных для выражения гена gfp под промоутер Cx3cr124 динамика в сетчатки заболевания21. Микроглии являются резидентов макрофаги сетчатки, которые играют решающую роль на ткани гомеостаза и восстановление тканей после травмы1,25,26. Микроглии активации в сетчатке было сообщено в сетчатки травмы и ишемии, вырождение, предлагая роль этих клеток сетчатки заболевания2,3,4,5, 6.

Целью настоящего Протокола является описание относительно простой метод для сетчатки изображений и измерение толщины сетчатки, используя SD-Октябрь и для визуализации gfp позитивные Микроглии клеток в сетчатке мыши Cx3cr1gfp/gfp с помощью SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT системы). Этот протокол может использоваться для визуализации и толщина измерений здоровыми или больными сетчатки в различных линиях мыши. Кроме того морфометрический анализ может выполняться для идентификации и количественной оценки микроглии чисел и микроглии активации в сетчатке, используя SLO21. Микроглии клеток, связанные с дегенеративными заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), в том числе Сетчатка27,,2829. Таким образом комбинируя два методы, используемые в настоящем Протоколе, корреляция микроглии распределения и дегенерации сетчатки могут быть сделаны, которые могут облегчить мониторинг тяжести заболевания или эффективность терапевтических подходов в естественных условиях.

Protocol

во всех процедурах, взрослых мужских и женских мышей BALB/c которые выражают gfp под промоутер Cx3cr1 были используется 24. Мышей обращались согласно заявлению Арво для использования животных в глазной и видение научных исследований и все процедуры были утверждены от правит…

Representative Results

С помощью протокола, представленные здесь, SD-Окт сканирует и SLO изображения были получены из Cx3cr1gfp/gfp мышей в том же сеансе изображений. Рисунок 3 включает в себя представитель SD-Окт одного сканирования, полученные с 30 ° или 55 ° объектив (<strong class…

Discussion

Настоящей статьи демонстрирует протокол для приобретения сетчатки Б-сканов и изображений gfp позитивные микроглии распределения в сетчатке мыши в том же сеансе изображений. SD-OCT и SLO все шире используются в животных моделях заболеваний сетчатки для предоставления информации сетчатки и?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Швейцарский Национальный научный фонд (SNSF; #320030_156019). Авторы получили нефинансовой поддержки от Heidelberg Engineering GmBH, Германия.

Materials

Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

Keywords: In Vivo ImagingCx3cr1gfp/gfp Reporter MiceSpectral-domain Optical Coherence TomographyScanning Laser OphthalmoscopyRetinal ThicknessMicroglial Cell DistributionNon-invasiveCorneal Contact LensInfrared ImagingAutofluorescence Imaging
check_url/pt/55984?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image