Det här protokollet beskriver hur högupplösta avbildningstekniker såsom spektrala domänen optisk koherenstomografi och scanning laser Oftalmoskopi kan utnyttjas i små gnagare, använder ett oftalmologiska imaging platform system, för att få information om retinal tjocklek och mikrogliala cell distribution, respektive.
Spektrala domänen optisk koherenstomografi (SD-okt) och scanning laser Oftalmoskopi (SLO) flitigt i experimentell oftalmologi. I detta protokoll, möss att uttrycka grönt fluorescerande protein (gfp) enligt arrangören av Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) användes till bild mikroglia celler i vivo i näthinnan. Mikroglia är bosatta makrofager av näthinnan och har varit inblandade i flera retinala sjukdomar1,2,3,4,5,6. Detta protokoll ger en detaljerad strategi för generering av retinal B-skanningar, med SD-okt och imaging mikroglia cell spridning i Cx3cr1gfp/gfp möss med SLO i vivo, använder ett system med oftalmologiska imaging i plattformen. Protokollet kan användas i flera reporter mus linjer. Det finns dock vissa begränsningar i protokollet som presenteras här. Först, både SLO och SD-okt, när den används i högupplöst läge, samla in data med hög axiell upplösning men lateral upplösning är lägre (3,5 µm och 6 µm, respektive). Fokus och mättnad nivån i SLO är dessutom starkt beroende av parametern urval och korrigera uppriktningen av ögat. Dessutom använder enheter utformade för mänskliga patienter hos möss är utmanande på grund av den högsta totala optiska effekten på möss jämfört med det mänskliga ögat; Detta kan leda till laterala förstoring felaktigheter7, som också är beroende av förstoringen med muslinsen det bland annat. Men trots att den axiella scan ställning är beroende av laterala förstoring, axial SD-okt mätningarna är korrekt8.
I experimentell oftalmologi utvärderas undersökning av retinal patologi vanligtvis med histologiska tekniker. Dock histologi kräver djur dödshjälp och kan orsaka förändring till faktiska egenskaper i vävnaden. SD-okt och SLO används rutinmässigt i kliniska oftalmologi för diagnostiska ändamål och för övervakning av flera retinala sjukdomar såsom Diabetiskt makulaödem9, främre ischemisk optikusneuropati10eller retinitis pigmentosa11 . SD-okt och SLO är icke-invasiv teknik som genererar högupplösta bilder av näthinnan, som visualiseras genom dilaterade pupillen utan inblandning. SD-okt ger information av näthinnans struktur och retinal tjocklek genom att samla backscattering data för att skapa tvärsnittsdata bilder av näthinnan, medan SLO samlar fluorescens data för att producera stereoskopisk bilder med hög kontrast av näthinnan. Numera både tekniker används alltmer i experimentell oftalmologi med smågnagare12,13,14,15 (eller ens zebrafiskar16,17) och kan ge både kvalitativ och kvantitativ information12,17,18,19,20,21.
Ackumulation av endogena fluorophores som lipofuscins eller bildandet av drusen i näthinnan kan visualiseras genom SLO som auto fluorescerande signal. Denna funktion gör SLO en värdefull teknik för diagnos och övervakning av retinala sjukdomar såsom åldersrelaterad makuladegeneration eller retinitis pigmentosa22,23. I experimentell oftalmologi användas auto fluorescens imaging (AF) för påvisande av specifika celltyper i reporter mus linjer. Till exempel är möss som är heterozygota för uttrycket av gfp enligt arrangören Cx3cr124 fördelaktiga för i vivo visualisering av mikrogliaceller i normala näthinnan och för utredning av mikroglia/makrofag Dynamics i retinal sjukdom21. Mikroglia är bosatta makrofager av näthinnan, som spelar en avgörande roll på vävnad homeostas och vävnad reparera vid skador1,25,26. Mikroglia aktivering i näthinnan har rapporterats i skada, ischemi och degeneration, vilket tyder på en roll av dessa celler i näthinnesjukdom2,3,4,5, 6.
Syftet med detta protokoll är att beskriva en relativt enkel metod för retinal imaging och mätning av retinal tjocklek med hjälp av SD-okt och visualisering av gfp positiva mikroglia celler i Cx3cr1gfp/gfp mus näthinnan med SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT system). Detta protokoll kan utnyttjas för imaging och tjocklek mätningar av friska eller sjuka näthinnor i olika mus linjer. Dessutom kan morfometriska analyser utföras för identifiering och kvantifiering av mikroglia nummer och mikroglia aktivering i näthinnan med SLO21. Mikroglia celler är associerade med degenerativa sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS), inklusive näthinnan27,28,29. Således, genom att kombinera de två metoder som används i detta protokoll, korrelation av mikroglia distribution och retinal degeneration kan göras, vilket kan underlätta övervakning sjukdomens svårighetsgrad eller effektiviteten av terapeutiska metoder i vivo.
Denna artikel visar ett protokoll för förvärvet av retinal B-skanningar och avbildning av gfp positiva mikroglia distribution i mus näthinnan i den samma bildsession. SD-okt och SLO används alltmer i djurmodeller av retinal sjukdom ge information av retinala förändringar över tid10,14,17,18,21. Med detta protokoll, Cx3cr1gfp/gfp el…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av ett bidrag från schweiziska National Science Foundation (SNSF; #320030_156019). Författarna fick icke-finansiella stöd från Heidelberg Engineering GmBH, Tyskland.
Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
+4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
silicon forceps | N/A | N/A | |
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |