Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM
Summary
Demostramos un método para la imagen de múltiples moléculas dentro de nano-estructuras heterogéneas con una sola molécula exactitud utilizando secuencial vinculante y elución de fluorescently marcó anticuerpos.
Abstract
La creación de imágenes de estructuras celulares heterogéneas mediante la microscopía de localización de moléculas individuales se ha visto dificultada por la precisión de localización y la capacidad de multiplexación inadecuadas. Utilizando marcadores fiduciales fluorescentes de nano-diamante, describimos los procedimientos de corrección y alineación de deriva requeridos para obtener alta precisión en microscopía de localización de molécula única. Además, se describe una nueva estrategia de multiplexación, madSTORM, en la que se dirigen múltiples moléculas en la misma célula usando unión secuencial y elución de anticuerpos fluorescentes. MadSTORM se demuestra en una célula T activada para visualizar las ubicaciones de los diferentes componentes dentro de una membrana-bound, multi-proteína estructura llamada el microcluster de células T receptor. Además, se discute la aplicación de madSTORM como una herramienta general para la visualización de estructuras multi-proteína.
Introduction
Se han desarrollado una variedad de técnicas de microscopía de super resolución para superar el límite de difracción de la microscopía óptica (~ 200 nm). Entre éstas se encuentra una categoría de técnicas denominadas microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) que incluye microscopía de localización por fotoactivación (PALM) y microscopía óptica de reconstrucción estocástica (STORM). Las técnicas SMLM comparten el uso de fluoróforos que pueden ser conmutados entre los estados (fluorescente) y apagado (oscuro / foto-conmutado), permitiendo la localización secuencial de la fluorescencia de las moléculas individuales 1 , 2 , 3 .
Debido a su compatibilidad con colorantes y microscopios comercialmente disponibles, STORM directa (dSTORM) se ha convertido en una técnica SMLM ampliamente adoptada 4 . DSTORM puede alcanzar rutinariamente una precisión de localización de ~ 10 nm, definida como la incertidumbre en el cálculo del centro de un difractoFunción de propagación de puntos limitados por iones (PSF). Sin embargo, a pesar de la alta precisión estimada utilizando los algoritmos de localización 5 , 6 , 7 , la determinación exacta de la ubicación real de las moléculas individuales se ha visto obstaculizada por una serie de cuestiones. En primer lugar, el movimiento mecánico de la etapa del microscopio durante la adquisición de imágenes añade una incertidumbre significativa a la precisión de localización. Como las imágenes SMLM se obtienen a lo largo de miles de marcos de lapso de tiempo, los movimientos a escala nanométrica de la etapa del microscopio pueden comprometer significativamente la precisión de la imagen de superresolución final 8 . Para compensar el movimiento de la etapa durante la adquisición de la imagen, la deriva de la etapa es comúnmente estimada a partir de la adaptación basada en regresión de localizaciones binned de la propia imagen (correlación cruzada) o localizaciones secuenciales de los marcadores fiduciales (corrección fiducial) 1 , 9 . Sin embargoEstos métodos requieren la optimización de múltiples parámetros para cada pila de imágenes y no pueden dar cuenta de movimientos de escenario a escalas de tiempo cortas tales como vibración mecánica. Las nanopartículas de oro y las bolas fluorescentes multicolores se han utilizado como marcadores fiduciales en SMLM, pero no son foto-estables y resultan en una precisión significativamente menor después de la corrección de la desviación que los nano-diamantes fluorescentes (FND) En madSTORM 10 .
Además del límite de difracción, la microscopía óptica está restringida además por límites espectrales. La visualización simultánea de objetivos múltiples requiere sondas fluorescentes con perfiles espectrales que no se superponen, restringiendo generalmente la microscopía de luz basada en fluorescencia a 6 colores y SMLM a 2-3 colores 4 , 11 , 12 . Además, la aberración cromática no lineal causa desalineación de las imágenes multicolor, wQue requieren amplios procedimientos de alineación utilizando marcadores fiduciales multicolor 8 , 13 . Para superar estos límites, los estudios previos han imaginado múltiples objetivos utilizando fotoblanqueo repetitivo o quimioterapia química de fluoróforos unidos secuencialmente 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Aunque estos métodos pueden superar los límites espectrales de la microscopia, el blanqueo por fluorescencia es conocido por ser un proceso tóxico 20 , y el blanqueo o apagado prolongado puede causar efectos secundarios no deseados tales como pérdida de reticulación. Además, la acumulación de sondas fluorescentes podría conducir al bloqueo estérico de sitios de unión en la muestra, impidiendo la multiplexación a gran escala y la focalización robusta de epítopos. Para evitar tal interferencia estérica, una recienteTudy logrado multiplexing utilizando intercambio estocástico de libremente difundir fragmentos de proteínas [ 21] . Mientras que este método permite el etiquetado denso de las estructuras celulares, requiere una preparación bioquímica extensa para aislar fragmentos peptídicos, no puede localizar posiciones de una sola molécula y no facilita fácilmente el multiplexado a gran escala usando sondas comercialmente disponibles. Presentamos un protocolo detallado de video que describe la unión secuencial y la elución de anticuerpos fluorescentes para la obtención de imágenes dSTORM (madSTORM) de tamaño limitado de anticuerpos, y el uso de nano-diamantes fluorescentes para lograr corrección y alineación precisa de la deriva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los procedimientos de multiplexación secuencial, corrección de deriva y alineación en madSTORM permiten una visualización precisa y altamente multiplexada de estructuras heterogéneas en células. 10 Además, madSTORM evita las limitaciones de la TORMENTA multicolor como la aberración cromática y las propiedades de fotosensibilización / emisión subóptimas de colorantes rojos no lejanos 9 , 12 . A medida que la etapa de elución r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Xufeng Wu por el acceso al microscopio STORM. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) Centro de Investigación del Cáncer y el Instituto Nacional de Pulmón del Corazón y la Sangre (NHLBI).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
Referências
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