Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü
Summary
Floro etiketli antikorların ardışık bağlanması ve elüsyonunu kullanarak heterojen nano yapılardaki çoklu molekülleri tek molekül doğruluğu ile görüntüleme yöntemi gösteriyoruz.
Abstract
Tek molekül lokalizasyonu mikroskopisini kullanarak heterojen hücresel yapıların görüntülenmesi yetersiz lokalizasyon hassasiyeti ve çoklama yeteneği tarafından engellenmiştir. Flüoresan nano elmas referans işaretleyiciler kullanarak, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobunda yüksek hassasiyet elde etmek için gereken sürüklenme düzeltme ve hizalama prosedürlerini açıkladık. Ayrıca, floresan antikorlarının ardışık bağlanması ve elüsyonu kullanılarak aynı hücrede birden fazla molekülün hedeflendiği yeni bir çoklama stratejisi madSTORM açıklanmaktadır. MadSTORM, T hücresi reseptör mikroklusteru adı verilen, membrana bağlı, çoklu proteinli yapıdaki farklı bileşenlerin yerlerini görselleştirmek için aktive edilmiş bir T hücresi üzerinde gösterilmiştir. Buna ek olarak, çoklu protein yapılarının görselleştirilmesi için genel bir araç olarak madSTORM'un uygulanması tartışılacaktır.
Introduction
Işık mikroskopisinin (~ 200 nm) kırınım sınırını aşmak için çeşitli süper-çözünürlüklü mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir. Bunların arasında, foto-aktivasyon lokalizasyonu mikroskopisi (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) içeren tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) adı verilen bir teknik kategorisi bulunmaktadır. SMLM teknikleri, (floresan) ve kapalı (karanlık / foto-anahtarlamalı) durumlar arasında değiştirilebilen, floresanın tekli moleküller 1 , 2 , 3'den sıralı lokalizasyona olanak tanıyan flüorofor kullanımını paylaşır.
Ticari olarak mevcut boyalar ve mikroskoplar ile uyumluluğu nedeniyle doğrudan STORM (dSTORM) yaygın bir şekilde benimsenen SMLM tekniği haline gelmiştir. DSTORM, bir kırınım merkezinin hesaplanmasında belirsizlik olarak tanımlanan ~ 10 nm lokalizasyon hassasiyetini rutin olarak gerçekleştirebilirIyon sınırlı nokta yayılım fonksiyonu (PSF). Bununla birlikte, lokalizasyon algoritmaları 5 , 6 , 7 kullanılarak yüksek hassasiyet tahmini yapılmasına rağmen, tek moleküllerin gerçek konumunun doğru olarak belirlenmesi bir takım hususlarla engellenmiştir. Birincisi, görüntü yakalama işlemi sırasında mikroskop kademesinin mekanik hareketi, lokalizasyon hassasiyetinde belirgin belirsizlik katmaktadır. SMLM görüntüleri binlerce zaman aşımı karesinden elde edildiğinde, mikroskop kademesinin nano ölçekli hareketi, son süper-çözünürlüklü görüntünün 8 hassasiyetini önemli ölçüde tehlikeye atabilir. Görüntü yakalama işlemi sırasında sahne hareketini telafi etmek için sahne kayması yaygın olarak, kendiliğinden yerleşimlerin resmin kendisinden regresyon temelli uydurulması (çapraz korelasyon) veya referans işaretlerinden sıralı lokalizasyonlar (referans düzeltme 1 , 9 ) ile tahmin edilir. ancak buradanBu yöntemler, her görüntü yığıtı için birden fazla parametrenin optimizasyonunu gerektirir ve mekanik titreşim gibi kısa zaman ölçeklerinde sahne hareketlerini hesaba katamaz. SMLM'de, altın nano parçacıkları ve çok renkli flüoresan boncuklar referans işaretleyiciler olarak kullanılıyor ancak foto-kararlı değiller ve sürüklenme düzeltildikten sonra kullanılan azot boşluğu-merkez flüoresan nano-elmas (FND) değerlerinden çok daha düşük hassasiyetle sonuçlanıyorlar MadSTORM 10'da .
Kırılma sınırına ek olarak, ışık mikroskopisi spektral sınırlarla daha da sınırlandırılmıştır. Birden fazla hedefin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi, örtüşmeyen spektral profilleri olan flüoresan sondaları gerektirir ve genellikle 6 renk ve SMLM'den flüoresan esaslı ışık mikroskopisi 4 , 11 , 12'ye kısıtlanır. Ayrıca, lineer olmayan renk sapmaları, çok renkli görüntülerin hizalamasına neden olur, wÇok renkli referans işaretleri 8 , 13 kullanarak geniş hizalama prosedürleri gerektirir. Bu sınırların üstesinden gelmek için, daha önceki çalışmalar, ardışık olarak bağlı fluoroforların 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19'un tekrarlayan fotoblokajı veya kimyasal söndürme kullanılarak çoklu hedefleri görüntülemiştir. Bu yöntemler mikroskopik spektrum sınırlarını aşabilmesine karşın floresans ağartma işlemi toksik bir süreçtir20 ve uzun süren ağartma veya söndürme, çapraz bağ kaybı gibi istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Ayrıca, flüoresan probların birikimi, numunedeki bağlanma alanlarının sterik olarak bloke edilmesine ve epitopların geniş çaplı çoğullama ve sağlam hedeflemesine engel olabilir. Bu tür sterik parazitlerden kaçınmak için, son zamanlardaTitizlikle serbestçe yayılmakta olan protein parçalarının stokastik değişimi kullanılarak çoğullama elde edilmiştir 21 . Bu yöntem, hücresel yapıların yoğun şekilde etiketlenmesine izin verirken, peptid parçalarını izole etmek için kapsamlı biyokimyasal hazırlık gerektirir, tek molekül konumlarını bulamaz ve piyasada bulunan problar kullanılarak büyük ölçekli çoğullamayı kolayca kolaylaştırmaz. Çoğaltılmış, antikor boyutuna sınırlı dSTORM (madSTORM) görüntüleme için floresan antikorların sıralı bağlanmasını ve elüsyonunu anlatan ayrıntılı bir video protokolünü sunmak ve hassas sürüklenme düzeltmesi ve hizalama yapmak için flüoresan nano-elmas kullanımı kullanmaktayız.
Protocol
Representative Results
Discussion
MadSTORM'daki sıralı çoğullama, sürüklenme düzeltme ve hizalama prosedürleri, hücrelerdeki heterojen yapıların hassas, çok yönlü görselleştirilmesini sağlar. 10 Buna ek olarak, madSTORM, çok uzak olmayan kırmızı renklerin 9 , 12 renk sapması ve alt optimal fotoğraflar / ışık emisyon özellikleri gibi çok renkli STORM'un sınırlamalarını önler. Seyreltme adımı, ardışık olarak bağlanan antikorlar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
STORM mikroskopuna erişim için Xufeng Wu'ya teşekkür ediyoruz. Bu araştırma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Kanser Araştırmaları Merkezi ve Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI )'nin İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
