Imagerie haute résolution et ultra-résolution des cellules T à l'aide de madSTORM
Summary
Nous démontrons une méthode pour imaginer des molécules multiples dans des nano-structures hétérogènes à une seule précision de la molécule en utilisant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps marqués par fluorescence.
Abstract
L'imagerie de structures cellulaires hétérogènes utilisant une microscopie de localisation à une seule molécule a été entravée par une précision de localisation insuffisante et une capacité de multiplexage. À l'aide de marqueurs fluorescents de nano-diamant fiducial, nous décrivons les procédures de correction de dérive et d'alignement requises pour obtenir une grande précision dans un microscope à localisation à une seule molécule. En outre, une nouvelle stratégie de multiplexage, madSTORM, est décrite dans laquelle de multiples molécules sont ciblées dans la même cellule en utilisant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps fluorescents. MadSTORM est démontré sur une cellule T activée pour visualiser les emplacements de différents composants dans une structure multi-protéine liée à la membrane appelée micro-cluster de récepteur de cellules T. En outre, l'application de madSTORM comme outil général pour la visualisation des structures multi-protéines est discutée.
Introduction
Une variété de techniques de microscopie de super résolution ont été développées pour surmonter la limite de diffraction du microscope optique (~ 200 nm). Parmi ceux-ci se trouve une catégorie de techniques appelées microscopie de localisation de molécules simples (SMLM) qui comprend la microscopie de localisation photo-activation (PALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM). Les techniques SMLM participent à l'utilisation de fluorophores qui peuvent être commutés entre des états fluorescents et des états décalés (numérisés ou numérisés), ce qui permet une localisation séquentielle de la fluorescence à partir de molécules 1 , 2 , 3 .
En raison de sa compatibilité avec les colorants et les microscopes disponibles dans le commerce, STORM direct (dSTORM) est devenu une technique SMLM largement adoptée 4 . DSTORM peut atteindre systématiquement une précision de localisation de ~ 10 nm, définie comme l'incertitude dans le calcul du centre d'un diffractFonction de propagation des points à limitation d'ions (PSF). Cependant, malgré la précision élevée estimée à l'aide des algorithmes de localisation 5 , 6 , 7 , une détermination précise de l'emplacement réel des molécules individuelles a été entravée par un certain nombre de problèmes. Tout d'abord, le mouvement mécanique du stade du microscope pendant l'acquisition de l'image ajoute une grande incertitude quant à la précision de localisation. Comme les images SMLM sont obtenues sur des milliers de trames temporelles, les mouvements en nano-échelle du stade du microscope peuvent compromettre de manière significative la précision de l'image finale de super résolution 8 . Pour compenser le mouvement de l'étape pendant l'acquisition de l'image, la dérive de l'étage est généralement estimée à partir d'un ajustement basé sur la régression des localisations binées de l'image elle-même (corrélation croisée) ou des localisations séquentielles des marqueurs fiduciaires (correction fiduciaire) 1 , 9 . HowevCes méthodes nécessitent l'optimisation de multiples paramètres pour chaque pile d'images et ne peuvent pas tenir compte des mouvements de l'étage à des échelles de temps courtes telles que des vibrations mécaniques. Les nanoparticules d'or et les perles fluorescentes multicolores ont été utilisés comme marqueurs fiduciaires dans le SMLM, mais ils ne sont pas stables à la photo et entraînent une précision nettement inférieure après la correction de la dérive que les nano-diamants fluorescents au centre d'inoccupation d'azote (FND) utilisés In madST 10 .
En plus de la limite de diffraction, le microscope optique est encore limité par des limites spectrales. La visualisation simultanée de multiples cibles nécessite des sondes fluorescentes avec des profils spectraux qui ne se chevauchent pas, limitant généralement le microscope optique à fluorescence à 6 couleurs et le SMLM à 2-3 couleurs 4 , 11 , 12 . En outre, l'aberration chromatique non linéaire provoque un désalignement des images multicolores, wQui nécessitent des procédures d'alignement étendues utilisant des marqueurs fiduciaires multicolores 8 , 13 . Pour surmonter ces limites, des études antérieures ont imaginé de multiples cibles en utilisant un photoblanchissement répétitif ou une trempe chimique des fluorophores liés aux séquences 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Bien que ces méthodes puissent surmonter les limites spectrales de la microscopie, le blanchiment par fluorescence est connu pour être un processus toxique 20 , et le blanchiment prolongé ou la trempe peut provoquer des effets secondaires indésirables tels que la perte de réticulation. En outre, l'accumulation de sondes fluorescentes pourrait conduire à un blocage stérique des sites de liaison dans l'échantillon, empêchant le multiplexage à grande échelle et le ciblage robuste des epitopes. Pour éviter de telles interférences stériques, un récent sLe multiplexage a eu lieu à l'aide d'un échange stochastique de fragments de protéines diffusant librement 21 . Alors que cette méthode permet un étiquetage dense des structures cellulaires, il nécessite une préparation biochimique étendue pour isoler les fragments de peptides, ne peut pas localiser des positions de molécules simples et ne facilite pas facilement le multiplexage à grande échelle en utilisant des sondes disponibles dans le commerce. Nous présentons un protocole vidéo détaillé décrivant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps fluorescents pour l'imagerie multiplexée, la technologie dSTORM (MadSTORM) limitée par l'anticorps et l'utilisation de nano-diamants fluorescents pour obtenir une correction et un alignement précis de la dérive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les procédures de multiplexage séquentiel, de correction de dérive et d'alignement dans madSTORM permettent une visualisation précise et hautement multiplexée des structures hétérogènes dans les cellules. 10 En outre, madSTORM évite les limitations de la STORM multicolore, telles que l'aberration chromatique et les propriétés de décodage / émission de photos non optimales des colorants non lointains 9 , 12 . Comme la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Xufeng Wu d'avoir accès au microscope STORM. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du Centre national de recherche sur le cancer (NCI) et l'Institut national du cancer du poumon et du sang (NHLBI).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
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