Imagerie haute résolution et ultra-résolution des cellules T à l'aide de madSTORM

Résumé

Nous démontrons une méthode pour imaginer des molécules multiples dans des nano-structures hétérogènes à une seule précision de la molécule en utilisant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps marqués par fluorescence.

Résumé

L'imagerie de structures cellulaires hétérogènes utilisant une microscopie de localisation à une seule molécule a été entravée par une précision de localisation insuffisante et une capacité de multiplexage. À l'aide de marqueurs fluorescents de nano-diamant fiducial, nous décrivons les procédures de correction de dérive et d'alignement requises pour obtenir une grande précision dans un microscope à localisation à une seule molécule. En outre, une nouvelle stratégie de multiplexage, madSTORM, est décrite dans laquelle de multiples molécules sont ciblées dans la même cellule en utilisant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps fluorescents. MadSTORM est démontré sur une cellule T activée pour visualiser les emplacements de différents composants dans une structure multi-protéine liée à la membrane appelée micro-cluster de récepteur de cellules T. En outre, l'application de madSTORM comme outil général pour la visualisation des structures multi-protéines est discutée.

Introduction

Une variété de techniques de microscopie de super résolution ont été développées pour surmonter la limite de diffraction du microscope optique (~ 200 nm). Parmi ceux-ci se trouve une catégorie de techniques appelées microscopie de localisation de molécules simples (SMLM) qui comprend la microscopie de localisation photo-activation (PALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM). Les techniques SMLM participent à l'utilisation de fluorophores qui peuvent être commutés entre des états fluorescents et des états décalés (numérisés ou numérisés), ce qui permet une localisation séquentielle de la fluorescence à partir de molécules

Protocole

Attention: veuillez consulter toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et cancérogènes. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de l'exécution du protocole, y compris l'utilisation de commandes techniques (hotte aspirante, boîte à gants) et équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons complets, chaussures fermées).

1. Imagerie multiplexée de cellules T activées

1. Conjuguer conjointement les anticorps avec le colorant Alexa-647 (A647)....

Résultats

La méthode séquentielle d'élution et de coloration a été utilisée pour produire l'image madSTORM multiplexée de microclusters et d'autres structures dans une cellule T Jurkat activée ( Figure 1 , voir les alignements des figures). Chaque image pseudo-colorée représente une série d'imagerie madSTIME acquise aux étapes 1.1.1 à 1.3.13. Comme décrit précédemment ¹⁰ , le champ de vision doit être surveillé pour le signal ré.......

Discussion

Les procédures de multiplexage séquentiel, de correction de dérive et d'alignement dans madSTORM permettent une visualisation précise et hautement multiplexée des structures hétérogènes dans les cellules. ¹⁰ En outre, madSTORM évite les limitations de la STORM multicolore, telles que l'aberration chromatique et les propriétés de décodage / émission de photos non optimales des colorants non lointains ^{9 , 12} . Comme la phase d'é.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre à lamelles à 8 puits	Lab-tek	155409
0,1 % Solution de poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920
NV-100 nm Nano-diamant fluorescent	Adamas	Red FND
anti-CD3&epsilon ; anticorps	BD Biosciences	555329
Albumine sérique bovine, Fraction V	KSE Scientific	98-100P
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
10 % Paraformaldéhyde	EMS	15712	Cancérogène
Gélatine de peau de poisson d’eau douce	Sigma-Aldrich	G7041
Alexa 647 Kit d’étiquetage d’anticorps	Thermo Fisher	A20186
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma-Aldrich	138924
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7154	Hautement toxique, sensible à l’air
Cysteamine	Sigma-Aldrich	30070	Hautement toxique
Cyclooctatétraène 98 %	Sigma-Aldrich	138924	Hautement toxique, sensible à l’air
10x PBS	KD Médical	RGF-3210
10x TBS	KD Médical	RGF-3385