Vi har beskrivit ett protokoll för att utföra partiell hepatectomy (PHx) och stamcellstransplantation via mjälte i NOD. SCID (NICKA. CB17-Prkdcscid/j) möss. I detta protokoll snitt ett att exponera och resect den vänstra LOB i levern följt av ett annat snitt för intrasplenic transplantation av celler.
Partiell hepatectomy är en mångsidig och reproducerbar metod att studera lever regenerering och effekten av cellbaserade therapeutics i olika sjukdomstillstånd. Partiell hepatectomy underlättar också ökad engraftment och spridningen av transplanterade celler av accelererande kärlnybildning och cellmigration mot levern. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för utför 30% hepatectomy och transplantation av celler i mjälten hos en icke-feta diabetiker/svår kombinerad nedsatt immunförsvar nicka. SCID (NICKA. CB17-Prkdcscid/j) mus.
Två små snitt görs i den här proceduren. Första snittet är att exponera och resect den vänstra LOB i levern, och en annan liten snitt att exponera mjälte för intrasplenic transplantation av celler. Detta förfarande kräver inte någon specialiserad kirurgisk kompetens, och det kan fyllas i 5-7 minuter med mindre stress och smärta, snabbare återhämtning och bättre överlevnad. Vi har visat transplantation av hepatocyter som isolerats från ett grönt fluorescerande protein (GFP) uttrycker mus (transgena C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) samt hepatocyte liknande celler av mänskligt ursprung (NeoHep) i delvis hepatectomized nicka. SCID möss.
För närvarande föreslås hepatocyte transplantation som ett alternativ till hela organtransplantation för behandling av patienter med allvarliga leversjukdomar. Man tror att det kan överbrygga patienter till hela organtransplantation1. Förutom de prövningar hepatocyter2utreds xenogen hepatocyter3 och hepatocyter härrör från stamceller4 också i djurmodeller. I detta sammanhang, homing och engraftment är potential de transplanterade cellerna i mottagaren ett viktigt kriterium för cellterapi baserat i akut leversvikt (AHF).
För att utreda transplantation av hepatocyter eller hepatocyte-liknande celler5, skapas AHF i en djurmodell av kirurgiska6 eller farmakologiska7 förfaranden, följt av omplantering celler. Att göra en AHF djurmodell av farmakologiska reagenser, många hepatotoxins såsom d-galactosamine8, paracetamol9, koltetraklorid10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysackarid13 , osv., har använts. Från den här listan varje reagens genererar en unik uppsättning funktioner för AHF, men tyvärr ingen enda reagens härmar den mänskliga hushållsfolie av aluminium. Dessutom den hushållsfolie av aluminium som induceras av hepatotoxins tar lång tid, som sätter djur under kronisk stress, och reproducerbara resultat är svårt att få.
Däremot, det kirurgiska ingreppet av partiell hepatectomy (PHx) är färdighet beroende och reproducerbara resultat är lätt att få efter att ha utvecklat färdigheter som krävs. För att inducera AHF av kirurgiska ingrepp ensam, krävs resektion av mer än 70% av levern; dock transplanterade mindre än en 70% hepatectomy kan fortfarande användas för att studera engraftment och spridning av celler i levern för att analysera deras terapeutiska kapacitet under leverskador14. Transplantation av hepatocyter har varit utförda post hepatectomy genom bukhinnan15, svans ven16, nedsatt ven17eller mjälte18. För närvarande är nedsatt ven infusion och intrasplenic transplantation av hepatocyter Rekommenderad förfarandena, eftersom de är lättare att reproducera.
I detta papper, har vi beskrivit ett förfarande för en 30% partiell hepatectomy i NOD. SCID (NICKA. CB17-Prkdcscid/J) möss där den vänstra LOB i levern Bolts. Det följs av transplantation av 0,2 miljoner GFP uttrycker mus (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocyter samt mänskligt ursprung NeoHep19 i mjälten. Detta förfarande leder till engraftment av de transplanterade cellerna i levern. Detta förfarande är den minst invasiva och en minimalt smärtsamt teknik.
Partiell hepatectomy är en etablerad teknik för utredande lever regenerering och överdriven hepatectomy rapporteras att efterlikna AHF modellen. Bland djurmodeller av Hushållsfolie av aluminium är gnagare, särskilt möss, den mest utforskade modellen. För att erhålla en leverskada modell i möss, upp till en 70% hepatectomy har rapporterats med en bra överlevnad kurs25,26. Men i naken och andra nedsatt immunförsvar mus, en 70% hepatectomy rapporterades …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av core bidraget fick från Institutionen för bioteknik, Indiens regering att den nationella institut för immunologi, New Delhi. Dr. Bhattacharjees nuvarande adress är sektionen för gastroenterologi, hepatologi och Nutrition, Children’s Hospital Los Angeles.
Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |