השתלת intrasplenic של Hepatocytes לאחר Hepatectomy חלקית ב במנוד ראש. SCID עכברים
Summary
תארנו פרוטוקול לביצוע חלקי hepatectomy (PHx), השתלת תא באמצעות הטחול ב במנוד ראש. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) עכברים. ב פרוטוקול זה, חתך לחשוף ולאחר נכרות האונה השמאלית של הכבד, ואחריו עוד חתך השתלת intrasplenic של תאים.
Abstract
Hepatectomy חלקית היא שיטה לשחזור רב-תכליתי ללמוד התחדשות הכבד ואת השפעת התא מבוסס הרפוי בתנאים פתולוגיים שונים. Hepatectomy חלקית מקלה גם engraftment מוגבר של התפשטות התאים המושתלים על ידי מאיץ כורוידאלית ואת נדידת תאים לכיוון הכבד. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור מבצע 30% hepatectomy והשתלת תאי הטחול של שאינו שמנים סוכרת/חמור בשילוב הנד immunodeficient. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) העכבר.
בהליך זה, מתבצעים שני חתכים קטנים. החתך הראשוני היא לחשוף ולאחר נכרות האונה השמאלית של הכבד, והוא חתך קטן אחר עשוי לחשוף את הטחול כבר intrasplenic של תאים. הליך זה אינו דורש כל כישורים מיוחדים, ניתן להשלים אותו תוך 5-7 דקות עם פחות לחץ, כאב, התאוששות מהירה יותר של הישרדות טוב יותר. הראו את השתלת של hepatocytes מבודד של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המבטאת העכבר (הטרנסגניים C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), כמו גם hepatocyte כמו תאים ממקור אנושי (NeoHep) ב חלקית hepatectomized במנוד ראש. SCID עכברים.
Introduction
כיום, השתלת hepatocyte מוצע כחלופה השתלת איברים כל בטיפול בחולים לאחר הפרעות כבד קשות. הוא האמין כי זה יכול לגשר בין חולים השתלת איברים כל1. בנוסף allogenic hepatocytes2, xenogenic hepatocytes3 ו hepatocytes שמקורם בתאי גזע4 גם נחקר במודלים של בעלי חיים. בהקשר זה, יונת, engraftment הפוטנציאל של התאים המושתלים של הנמען הוא קריטריון חשוב עבור טיפול בתאי מבוסס על כשל של הכבד חריפה (AHF).
עבור חוקרים את השתלת hepatocytes או תאים דמויי hepatocyte5, AHF נוצרת במודל חיה כירורגי6 או תרופתי7 נהלים, ואחריו משתילים תאים. כדי להפוך מודל חיה AHF על ידי ריאגנטים תרופתי, hepatotoxins רבים כגון d-galactosamine8, פרצטמול9, פחמן tetrachloride10, thioacetamide11, Concanavalin A12, ליפופוליסכריד13 , ועוד., היו בשימוש. מתוך רשימה זו, כל ריאגנט יוצר קבוצת תכונות ייחודיות עבור AHF, אך למרבה הצער לא מגיב יחיד מחקה את AHF האנושית. יתר על כן, AHF שנגזרות hepatotoxins אורכת זמן רב, אשר מעמידה חיות תחת מתח כרוני, ויש תוצאות לשחזור קשה להשיג.
מצד שני, ההליך הכירורגי של חלקי hepatectomy (PHx) היא מיומנות התלויים, תוצאות לשחזור קל להשיג לאחר פיתוח הכישורים הנדרשים. כדי לגרום AHF על ידי התערבות כירורגית לבד, נדרשת כריתה של יותר מ 70% של הכבד; עם זאת, פחות ממה hepatectomy 70% עדיין יכול להיות מנוצל כדי ללמוד engraftment והתפשטות של מושתלים תאי הכבד לניתוח יכולת טיפולית שלהם במהלך פגיעה בכבד14. ההשתלה של hepatocytes כבר hepatectomy פוסט שבוצעו דרך ה צפק15, וריד הזנב16, וריד הכבד17או את הטחול18. כיום, וריד הכבד אינפוזיה והשתלות intrasplenic של hepatocytes הן ההליכים מועדף, הם יותר קל להתרבות.
בנייר זה, תארנו הליך של hepatectomy חלקי 30% ב במנוד ראש. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) שבו טוחנות האונה השמאלית של הכבד הוא עכברים. זה ואחריו השתלת hepatocytes העכבר (6/C57BL-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) לביטוי GFP 0.2 מיליון וכן מקור אנושי NeoHep19 של הטחול. הליך זה מוביל engraftment של התאים המושתלים בכבד. ההליך זה לפחות פולשני, טכניקה כואב מינימלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatectomy חלקית היא טכניקה הוקמה עבור החקירה התחדשות הכבד, hepatectomy מוגזמת הוא דיווח כדי לחקות את מודל AHF. בין מודלים חייתיים של AHF, מכרסמים, עכברים במיוחד, הם המודל הכי חקר. כדי להשיג פגיעה בכבד מודל בעכברים, עד hepatectomy 70% דווח עם הישרדות טוב שיעור25,26. עם זאת בעירום, עכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המענק הליבה קיבל את המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו על המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. הכתובת הנוכחית של ד ר Bhattacharjee הוא חטיבת לגסטרואנטרולוגיה, Hepatology, תזונה, החולים בלוס אנג’לס לילדים.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase’s analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure?. Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- . . Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
