Kvantitativ immunohistokemi hos den cellulära mikromiljön vid patientglioblastomresektioner
Summary
Detta protokoll utvecklades för att kvantitativt identifiera tumörmikromiljökomponenter i glioblastom-patientresektioner med användning av kromogen immunhistokemi och ImageJ.
Abstract
Med det växande intresset för tumörmiljömiljö, satte vi fram för att utveckla en metod för att specifikt bestämma mikromiljökomponenterna inom patientprover av glioblastom, den dödligaste och mest invasiva hjärncancer. Inte bara är kvantitativa metoder som är fördelaktiga för att noggrant beskriva sjuka vävnader, de kan också potentiellt bidra till mer noggrann prognos, diagnos och utveckling av vävnadstekniska system och ersättningar. I glioblastom har glialceller, såsom mikroglia och astrocyter, oberoende korrelerats med dålig prognos baserad på patologens klassificering. Dock har tillståndet för dessa celler och andra glialcellskomponenter inte beskrivits väl kvantitativt. Detta kan vara svårt på grund av de stora processerna som markerar dessa glialceller. Vidare fokuserar de flesta histologiska analyserna på det totala vävnadsprovet eller endast inom huvuddelen av tumören, i motsats till att avgränsa kvantifieringar baserade på regioner vitHin den mycket heterogena vävnaden. Här beskriver vi en metod för att identifiera och kvantitativt analysera populationerna av glialceller inom tumörmassan och intilliggande regioner av tumörresektioner från glioblastompatienter. Vi använde kromogen immunhistokemi för att identifiera glialcellspopulationerna i patienttumörresektioner och ImageJ för att analysera procenttäckning av färgning för varje glialpopulation. Med dessa tekniker kan vi bättre beskriva glialcellerna i regionerna av gliomörkermikro-miljön.
Introduction
Glioblastom (GBM), den vanligaste och maligna hjärncancer, präglas av mycket diffus invasion från den primära tumörmassan i den omgivande friska hjärnparenchynen 1 , 2 . Denna diffusa invasion gör tumören speciellt svår att resekta fullständigt, och de invaderande cancercellerna som förblir postterapi är den vanligaste orsaken till oundviklig återkommande 2 , 3 , 4 . Tidigare fann vi att den diffusa gliomcellinvasionen hämmades för att vara terapeutiskt fördelaktig 5 , men lite är känt om de komplexa mekanismerna som bidrar till GBM-invasionen. Tumörmiljömiljön, eller vävnaden som omger cancer, har blivit involverad i progressionen av tumörer i flera cancerformer 6 , 7 . Glioblastom-tumörmiljömiljön, på sidArtikulär, är relativt underkännetecknad och är unikt komplex, komposition av flera glialceller, såsom astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter, såväl som extracellulär matris, lösliga faktorer och biofysiska faktorer. Experimentellt har astrocyter och microglia visat sig öka gliomprogressionen och invasionen 8 , 9 , 10 , men sammansättningen av alla glialceller i den ursprungliga mänskliga hjärnmikro-miljön är okänd.
Vi visade tidigare mikromiljökomponenter kan förutsäga patientöverlevnad genom att kvantitativt analysera cellkomponenter i glioblastommikro-miljön och införliva våra analyser i en proportionell riskmodell 11 . Här beskriver vi den kvantitativa analysmetoden för att identifiera populationerna av glialceller i tumörmassan och intilliggande regioner av tumörresektioner från glioblastompatientens. Vi använde kromogen immunhistokemi för att identifiera glialcellspopulationerna och ImageJ för att analysera procent täckningsfärg för varje glialpopulation. Att bedöma procent täckning skapar en enkel mätning för att bestämma de morfologiska skillnaderna i celler, särskilt de som påverkas av interaktioner med cancerceller. Tidigare studier för kvantifiering av histopatologisk färgning använder standardfärgning, såsom hematoxylin och eosin 12 eller Massons trichrom 13 , vilka inte utnyttjar specificiteten av antikroppsbaserad immunohistokemisk färgning. Vår metod har utvecklats för direkt kvantifiering av glialpopulationerna inom glioblastom-patienttumörresektioner, som vi syftar till att använda för att belysa den komplexa glioblastommikro-miljön.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår metod som föreslås här är ett kvantitativt tillvägagångssätt för att analysera histologiska prover färgade med traditionell kromogen immunhistokemi. Nuvarande metodik för denna typ av analys innefattar liknande färgningsprotokoll följt av gradering av oberoende patologer. Denna metod har varit pålitlig, men för ett antal tillämpningar krävs en mer exakt förståelse av cellulär smink, såsom bättre förståelse för heterogeniteten i samband med tumörer och exakt rekapitulation av tumörer för i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Drs. Fahad Bafakih och Jim Mandell för förvärv och identifiering av patientprover, Garrett F. Beeghly för hjälp med immunhistokemi och Biorepository and Tissue Research Facility, Histology Core Cardiovascular Research Center och Biomolecular Analysis Facility vid University of Virginia för hjälp med Provförvärv, immunhistokemi och bildbehandling.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
- Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
- Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
- Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
- Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
- Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
- Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
- Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
- Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
- Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
- Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
- Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?. Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
- Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
- Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).
