אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה
Summary
פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.
Abstract
עם העניין הגובר של microenvironment הגידול, יצאנו לפתח שיטה כדי לקבוע במיוחד את רכיבי microenvironment בתוך דגימות החולה של glioblastoma, סרטן המוח הקטלני הפולשני ביותר. לא רק שיטות כמותיות מועילות לתיאור מדויק של רקמות חולים, הם יכולים גם לתרום פרוגנוזה מדויקת יותר, אבחון, ופיתוח של מערכות הנדסה רקמות תחליפים. ב glioblastoma, תאים גליה, כגון microglia ו astrocytes, היו מתואמים באופן בלתי תלוי עם פרוגנוזה גרועה על פי דירוג הפתולוג. עם זאת, מצבם של תאים אלה ורכיבי תא גליה אחרים לא תוארו באופן כמותי. זה יכול להיות קשה בשל תהליכים גדולים לסמן תאים אלה גליה. יתר על כן, רוב הניתוחים היסטולוגית להתמקד מדגם הרקמה הכוללת או רק בתוך חלק הארי של הגידול, בניגוד כימות שרטוט מבוסס על שנינות אזוריםהין הרקמה ההטרוגנית ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לזיהוי כמותי וניתוח של אוכלוסיות של תאים גליה בתוך בתפזורת הגידול באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולים glioblastoma. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה בגידולים הגידול המטופל ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. בעזרת טכניקות אלה אנו מסוגלים לתאר טוב יותר את התאים גליה ברחבי אזורים של microivironment הגידול glioma.
Introduction
Glioblastoma (GBM), סרטן השד הנפוץ ביותר וממאיר, מאופיין פלישה מפוזר מאוד מן הגידול העיקרי הראש לתוך parenchyma המוח בריא 1 , 2 . הפלישה המפוזרת הזו גורמת לגידול קשה במיוחד להתרחש באופן מלא, ותאי הסרטן הפולשים שנותרו לאחר הטיפול הם הסיבה השכיחה ביותר להישנות בלתי נמנעת 2 , 3 , 4 . בעבר, מצאנו מעכב את הפלישה לתאי גליומה מפוזר להיות מועיל מבחינה טיפולית 5 , אולם מעט ידוע על מנגנונים מורכבים התורמים פלישה GBM. הגידול microenvironment, או רקמות המקיפות את הסרטן, כבר מעורב בהתקדמות של גידולים במספר סוגי סרטן 6 , 7 . הגידול microivironment הגידול glioblastoma, בעמ 'ארטיקולרי, הוא יחסית מאופיין והוא מורכב במיוחד, חיבור של תאים גליה מרובים, כגון אסטרוציטים, microglia, ו oligodendrocytes, כמו גם מטריקס תאיים, גורמים מסיסים, גורמים ביו-פיזי. ניסיוני, astrocytes ו microglia הוצגו כדי להגביר את התקדמות glioma ו פלישה 8 , 9 , 10 , אבל את ההרכב של כל תאי גליה של microenvironment המוח האנושי אינו ידוע.
הראינו בעבר רכיבים microenvironmental יכול לחזות הישרדות המטופל על ידי כמותית ניתוח מרכיבי הסלולר של microivironment glioblastoma ושילוב הניתוחים שלנו לתוך מודל סיכונים יחסיים 11 . כאן, אנו מתארים את שיטת ניתוח כמותי לזיהוי אוכלוסיות של תאים גליה בתוך הגידול בתפזורת באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולה glioblastomaS. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה chromogenic כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. הערכת אחוז כיסוי יוצר מדידה פשוטה לקביעת הבדלים מורפולוגיים של תאים, במיוחד אלה מושפעים אינטראקציות עם תאים סרטניים. מחקרים קודמים לכימות מכתים היסטופאתולוגיים משתמשים בכתמים סטנדרטיים כגון hematoxylin ו- eosin 12 או Trichrome 13 של Masson, אשר אינם מנצלים את הספציפיות של מכתים אימונוהיסטוכימיים המבוססים על נוגדנים. השיטה שלנו פותחה כדי לכמת ישירות את אוכלוסיות גלייה בתוך resioblastoma החולה גידולים הגידול, אשר אנו שואפים להשתמש כדי להבהיר את microivironment glioblastoma מורכבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצעת כאן היא גישה כמותית לניתוח דגימות היסטולוגית מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית המסורתית. המתודולוגיה הנוכחית עבור סוג זה של ניתוח כולל פרוטוקולים מכתים דומים ואחריו לדירוג על ידי פתולוגים עצמאיים. שיטה זו היתה מהימנה, אולם עבור מספר יישומים, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד"ר. פאהד באפאקיה וג'ים מנדל על רכישת וזיהוי דגימות החולה, גארט פ'ביילי לעזרה עם אימונוהיסטוכימיה, וכן מאגר ביאורוספטורי ומחקר מחקר רקמות, המרכז לחקר הלב וכלי הדם במרכז ההיסטולוגיה ומכון המחקר ביומולקולרי באוניברסיטה של וירג'יניה. רכישת מדגם, אימונוהיסטוכימיה, והדמיה.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
- Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
- Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
- Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
- Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
- Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
- Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
- Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
- Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
- Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
- Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
- Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?. Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
- Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
- Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).
