Summary

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

Published: September 13, 2017
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Summary

これは、栄養のショウジョウバエ毒性に関与している基本的な分子メカニズムの理解のためのモデルの肥満を誘発する高脂肪食です。ショウジョウバエと様々 な食物、環境、遺伝的または生理学的な条件の下で可能性があります他の (昆虫) モデルの脂肪蓄積を測定高スループット triacylglyceride 分析を提供します。

Abstract

心臓病は、世界中の人間の死の第 1 原因です。数多くの研究は、人間の肥満と心疾患との間の強力な接続を示しているより多くのツールと研究努力は良い関与の解明に必要な。世紀以上ショウジョウバエの遺伝的非常に解き得るモデルは、キー遺伝子と種を渡って節約される非常に証明した分子経路の発見に尽力されています。多くの生物的プロセスと疾患メカニズム機能開発 (例えば、ボディー プラン、心)、がん、神経変性疾患など、その場で保存されます。最近では、肥満やモデル生物で心臓病などの二次疾患の研究は人間のメタボリック症候群に関与する主調整装置の識別に非常に重要な役割を果たしています。

ここでは、効率的なツールとして、肥満、すなわち、過剰な脂肪の蓄積を誘導し、タグの蓄積の形で脂肪のコンテンツを監視する効率的なプロトコルを開発このモデル生物を使用する提案します。非常に節約されただけでなく、以下の複雑なゲノム、フライは急速な実験、費用対効果と組み合わせての短い寿命もあります。このペーパーは、高脂肪の食事療法 (HFD) 肥満と脂肪、再現性の高いことを目的に関連する増加を測定するための高スループット triacylglyceride (タグ) アッセイを誘発するショウジョウバエの餌の詳しいプロトコルを提供しますと大規模な遺伝的または化学スクリーニングのため効率的です。これらのプロトコルは、効率的に、肥満に関係する規制メカニズムの調査し同様、創薬研究開発に及ぼす薬剤の候補者の試験のための標準化されたプラットフォームを提供する新しい機会を提供または肥満、糖尿病関連代謝疾患の予防。

Introduction

我々 は、肥満とその関連の経済負担が世界的な問題1時間です。すべての 3 つのアメリカ人のうち 2 つは太りすぎまたは肥満関連の心臓病理学、成人2以内の死亡の主な原因であります。モデル生物を用いたメタボリック シンドロームの調節に関与する遺伝的および分子コンポーネントを適切に調査する新しい効率的な方法が必要です。この理由から、ヒトとマウス3,4,5,6を含む哺乳類で最も基本的な生物的プロセスを共有するのでミバエショウジョウバエモデルを選択します。ショウジョウバエのゲノムの進化の過程で非常に節約されたが、全体的にはるかに少ない遺伝子重複と代謝複雑さで、多くの人間の病気4に関与する基本的なメカニズムを理解するために理想的な小さい,7,8しますまた、脂肪組織、消化管によって特徴的なプロセスが実施と膵臓がフライで表され、人間9,に類似している糖・脂質代謝、たとえば、規制機能を仲介する。10,11。また、肥満、インスリン抵抗性や人間の糖尿病のコントロールに関与する基本的な分子経路はキイロショウジョウバエ12,13,14保存機能,15,16. 高等生物のようなショウジョウバエが哺乳類心臓3,17のそれに類似したプロセスによって開発中に形成される心臓の鼓動。したがって、プロトコルと高スループット タグ分析、ショウジョウバエの遺伝学的ツール ボックスを使用して有効なスクリーニング目的のために適応を供給信頼性の高い HFD の開発研究し、遺伝的基礎を理解するための重要な手段を提供します。複雑な代謝性疾患の基になります。

HFD 食品自体はほとんど18メタボリック シンドロームと関連付けられる知られている飽和脂肪酸で構成されているココナッツ オイルを添加した標準研究所はえの食糧から作られます。齧歯動物などの哺乳類モデルで肥満を誘発するヶ月19,20を取ることができる、私たちの最適化された HFD 効果的かつ再現性をもって、ショウジョウバエのプロトコルを供給増加の問題で個体の脂肪分日12,14。このプロトコルでは、タグの高スループット試金と組み合わせて効率的な検診遺伝的要因、環境の影響および脂肪質の新陳代謝の新しい変調器を発見する新薬候補の効果をことができます。その結果、これらのプロトコルは、理解や戦闘肥満および肥満関連人間の病理学に関連します。

餌のプロトコルは多目的、単一の飽和または不飽和の脂肪酸の代謝と機能の効果を研究に適用可能性があります。タグにあるこの高スループットの分析の使用、キイロショウジョウバエに限定されないが、キューティクルやタフな細胞外マトリックス (例えば、他のショウジョウバエの種、線虫と小さいモデル有機体の様々 な適応があります。およびその他の新興の無脊椎動物モデル) 代謝病期や成人期開発のあらゆる段階で異なる環境、遺伝的または生理学的な条件の下で脂肪の量を測定します。タグ アッセイは遊離脂肪酸、グリセロール、グリセロール 3-リン酸、最終的に 4-アミノアンチピリン (4-AAP) と 3, 5 – と反応して H2O2にタグが低下する酵素反応の一連の比色測定に基づいてジクロロ-2-ヒドロキシ ベンゼン スルホン酸 (3, 5 DHBS) 96 ウェルの分光光度計を用いて測定した赤い色の製品を生産します。

Protocol

1。 栄養 HFD テーブル 1。フライ食品のレシピ 。 この表は、当社のコントロールの食品を準備するための異なる材料をまとめます。食品の 10 mL バイアルに注がれ、冷却、長期的な保存のための 4 ° C で保存に行ったら、. HFD 準備 高脂肪食品の 1 キロをするためには、既製の?…

Representative Results

キイロショウジョウバエ、という場合に、他の種の間にある性の二形性男女22。男性22より、腹部の脂肪質に、女性が多いことが知られています。提案プロトコルの有効性をテストするには、タグ規格研究所野生型 (w1118) の男女の違いをタグの内容にハエを決定するアッセイを行った。データは、女性がある男?…

Discussion

マウスの肥満誘導は、ヶ月19,20を取ることができます。ハエ、プロトコルを供給この HFD は日以内の 18 h (図 2を参照) 後にのみ脂肪蓄積の増加を引き起こしている問題で過剰の脂肪蓄積の誘導のことができます。HFD 説明プロトコルと餌はグルコース コンテンツ12を増加し、 Bmmリパーゼと PGC 1 式<sup class=…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々 はこの原稿を編集のエリカ ・ テイラーを感謝したいです。この作品は、国立衛生研究所 (P01 HL098053、P01 AG033561 および R01 HL054732) r. b. に、博士課程終了後の研究サプリメント (R01 HL085481) と親睦 (AAUW) から S.B.D.、助成金、S.B.D. に米国心臓協会からの助成金によって賄われていた・ R.T.B.

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

Referências

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Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

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