تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية
Summary
هذا نظام غذائي الدهون عالية التغذية البروتوكول للحث على السمنة في المورفولوجية، نموذجا لفهم الآليات الجزيئية الأساسية المتورطين في ليبوتوكسيسيتي. كما يوفر مقايسة ترياسيلجليسيريدي إنتاجية عالية لقياس تراكم الدهون في أخرى يحتمل أن تكون نماذج (الحشرات) تحت مختلف الظروف الغذائية أو البيئية أو الوراثية أو الفسيولوجية و المورفولوجية .
Abstract
أمراض القلب هي السبب الأول للوفيات البشرية في العالم. وأظهرت العديد من الدراسات اتصالات قوية بين السمنة وقصور القلب في البشر، ولكن المزيد من الأدوات وجهود البحوث ضرورية لتوضيح أفضل الآليات التي ينطوي عليها. لأكثر من قرن، كانت مفيدة في اكتشاف الجينات الرئيسية والمسارات الجزيئية التي ثبت أنها تكون حفظت عاليا عبر الأنواع نموذج المورفولوجية وراثيا على درجة عالية من المرونة. العديد من العمليات البيولوجية وآليات المرض هي المصانة وظيفيا في الطيران، مثل التنمية (مثلاً، خطة الجسم، القلب)، والسرطان، وأمراض الأعصاب. في الآونة الأخيرة، دراسة السمنة والأمراض الثانوية، مثل أمراض القلب في نموذج الكائنات، لعبت دوراً تنتقد بشدة في التعرف على المنظمين الرئيسيين المتورطين في المتلازمة الأيضية في البشر.
وهنا، نقترح استخدام هذا الكائن النموذج كأداة فعالة للحث على السمنة، أي، تراكم الدهون، ووضع بروتوكول فعال لرصد محتوى الدهون في شكل تراكم العلامات. بالإضافة إلى حفظت عاليا، ولكن أقل تعقيداً الجينوم، قد الطاير أيضا عمر قصيرة للتجريب السريع، جنبا إلى جنب مع الفعالية من حيث التكلفة. تقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلاً “الدهون في” النظام الغذائي (HFD) عالية التغذية في المورفولوجية للحث على السمنة ومقايسة ترياسيلجليسيريدي (العلامة) إنتاجية عالية لقياس الزيادة المرتبطة بها في محتوى الدهون، بهدف أن تكون الغاية استنساخه و كفاءة للفحص الوراثي أو الكيميائية على نطاق واسع. هذه البروتوكولات وتتيح فرصاً جديدة كفاءة التحقيق في الآليات التنظيمية المعنية بالسمنة، فضلا عن توفير منصة موحدة لبحوث اكتشاف المخدرات للاختبار السريع لتأثير المخدرات المرشحين على تطوير أو الوقاية من السمنة ومرض السكري والأمراض الأيضية.
Introduction
ونحن في زمن حيث السمنة، والأعباء الاقتصادية المرتبطة به، هي مشكلة في جميع أنحاء العالم1. اثنان من كل ثلاثة أميركيين هم يعانون من زيادة الوزن أو السمنة بأمراض القلب ذات الصلة، السبب الرئيسي للموت داخل السكان البالغين2. أساليب فعالة جديدة مطلوبة للتحقيق على نحو كاف المكونات الوراثية والجزيئية المتورطين في التنظيم لمتلازمة الأيض استخدام نموذج الكائنات الحية. ولهذا السبب، علينا اختيار نموذج المورفولوجية ذبابة الفاكهة نظراً لأنها تشترك في العمليات البيولوجية الأساسية مع الثدييات، بما في ذلك الفئران والبشر3،4،،من56. الجينوم المورفولوجيةالمصانة عاليا خلال تطور لكن عموما أصغر بكثير مع تقليل الازدواجية الجينات والأيضية التعقيد، مما يجعله مثاليا لفهم الآليات الأساسية التي تورط في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان4 , 7 , 8. أيضا، العمليات المميزة التي تقوم بها الأنسجة الدهنية، القناة الهضمية والبنكرياس وتتمثل في يطير والتوسط من أجل المهام التنظيمية في استقلاب السكر والدهون، على سبيل المثال، التي مماثلة للبشر9، 10،11. وعلاوة على ذلك، المسارات الجزيئية الأساسية المعنية بمكافحة السمنة ومقاومة الأنسولين ومرض السكري في البشر هي المصانة وظيفيا في melanogaster المورفولوجية12،،من1314 , 15 , 16-مثل الكائنات الحية العليا، المورفولوجية له قلب ضرب التي شكلتها عمليات مماثلة لل3،قلب الثدييات17أثناء التطوير. وهكذا، وضع HFD موثوقة تغذية البروتوكول والمقايسة علامة عالية الإنتاجية، تكييفها لأغراض فحص كفاءة استخدام مربع الأدوات الجينية من المورفولوجية، توفر وسيلة هامة دراسة وفهم الأساس الجيني الكامنة وراء الأمراض الأيضية المعقدة.
الطعام HFD نفسه مصنوع من طعام يطير مختبر قياسية وتستكمل مع زيت جوز الهند، التي يتكون معظمها من الأحماض الدهنية المشبعة التي من المعروف أن تترافق مع متلازمة الأيض18. في حين حمل السمنة في نماذج الثدييات، مثل القوارض، يمكن أن يستغرق أشهر19،20، HFD الأمثل لدينا تغذية البروتوكول في المورفولوجية فعالية وتكاثر يزيد المحتوى العضوي من الدهون في غضون 12،أيام14. يسمح هذا البروتوكول، بالاقتران مع مقايسة عالية إنتاجية العلامة، كفاءة الفحص الشامل لآثار العوامل الوراثية والتأثيرات البيئية والمرشحين المخدرات ليكتشف المغيرون جديدة للتمثيل الغذائي للدهون. ونتيجة لذلك، يرجح هذه البروتوكولات ذات الصلة فهم و/أو مكافحة السمنة والأمراض البشرية المرتبطة بالسمنة.
البروتوكول تغذية متعددة الاستعمالات ويمكن تطبيقها على دراسة الآثار الأيضية والوظيفية لواحد من الأحماض الدهنية المشبعة أو غير المشبعة. استخدام هذا الفحص علامة عالية الإنتاجية لا تقتصر على melanogaster دال، ولكن يمكن أن تتكيف مع مجموعة متنوعة من الكائنات نموذج صغير مع بشرة أو صعبة مصفوفات خارج الخلية (مثلاً، وغيرها من الأنواع المورفولوجية ، C. ايليجانس والأخرى الناشئة الكائنات اللافقارية النموذجي) لقياس الدهون تحت مختلف الظروف البيئية أو الوراثية أو الفسيولوجية، في أي مرحلة من مراحل التنمية، ومرحلة البلوغ أو مرحلة المرض الأيضي. فحص العلامة يستند إلى مقياس قياس ألوان لسلسلة من التفاعلات الانزيمية التي تتحلل العلامات في الأحماض الدهنية الحرة والجلسرين ووالغليسيرول 3-الفوسفات، وأخيراً ح2س2 أن يتفاعل مع 4-أمينوانتيبيريني (4-الوكالة الأسترالية) و 3، 5- ثنائي-2-هيدروكسيبينزيني المشبعة بالفلور أوكتين (المجالس 3.5) لإنتاج منتج ملونة حمراء التي يتم قياسها باستخدام جهاز المطياف الضوئي 96-جيدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعريفي السمنة في الفئران يمكن أن يستغرق أشهر19،20. في الذباب، يسمح هذا HFD تغذية البروتوكول لتحريض تراكم الدهون الزائدة في غضون أيام أو أقل، مما تسبب في زيادة في تراكم الدهون إلا بعد 18 ساعة (انظر الشكل 2). HFD تغذية مع بروتوكول وصف يزيد محتوى الج?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر تايلور إريكا لتحرير هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من المنح التي تقدمها “المعاهد الوطنية للصحة” (P01 HL098053، P01 AG033561 و R01 HL054732) إلى سنغ، الملحق أبحاث ما بعد الدكتوراه (R01 HL085481) والزمالة (أوو) إلى S.B.D.، والمنح المقدمة من “جمعية القلب الأمريكية” إلى S.B.D. و R.T.B.
Materials
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
Referências
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015)
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genética. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
