高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金
Summary
これは、栄養のショウジョウバエ毒性に関与している基本的な分子メカニズムの理解のためのモデルの肥満を誘発する高脂肪食です。ショウジョウバエと様々 な食物、環境、遺伝的または生理学的な条件の下で可能性があります他の (昆虫) モデルの脂肪蓄積を測定高スループット triacylglyceride 分析を提供します。
Abstract
心臓病は、世界中の人間の死の第 1 原因です。数多くの研究は、人間の肥満と心疾患との間の強力な接続を示しているより多くのツールと研究努力は良い関与の解明に必要な。世紀以上ショウジョウバエの遺伝的非常に解き得るモデルは、キー遺伝子と種を渡って節約される非常に証明した分子経路の発見に尽力されています。多くの生物的プロセスと疾患メカニズム機能開発 (例えば、ボディー プラン、心)、がん、神経変性疾患など、その場で保存されます。最近では、肥満やモデル生物で心臓病などの二次疾患の研究は人間のメタボリック症候群に関与する主調整装置の識別に非常に重要な役割を果たしています。
ここでは、効率的なツールとして、肥満、すなわち、過剰な脂肪の蓄積を誘導し、タグの蓄積の形で脂肪のコンテンツを監視する効率的なプロトコルを開発このモデル生物を使用する提案します。非常に節約されただけでなく、以下の複雑なゲノム、フライは急速な実験、費用対効果と組み合わせての短い寿命もあります。このペーパーは、高脂肪の食事療法 (HFD) 肥満と脂肪、再現性の高いことを目的に関連する増加を測定するための高スループット triacylglyceride (タグ) アッセイを誘発するショウジョウバエの餌の詳しいプロトコルを提供しますと大規模な遺伝的または化学スクリーニングのため効率的です。これらのプロトコルは、効率的に、肥満に関係する規制メカニズムの調査し同様、創薬研究開発に及ぼす薬剤の候補者の試験のための標準化されたプラットフォームを提供する新しい機会を提供または肥満、糖尿病関連代謝疾患の予防。
Introduction
我々 は、肥満とその関連の経済負担が世界的な問題1時間です。すべての 3 つのアメリカ人のうち 2 つは太りすぎまたは肥満関連の心臓病理学、成人2以内の死亡の主な原因であります。モデル生物を用いたメタボリック シンドロームの調節に関与する遺伝的および分子コンポーネントを適切に調査する新しい効率的な方法が必要です。この理由から、ヒトとマウス3,4,5,6を含む哺乳類で最も基本的な生物的プロセスを共有するのでミバエショウジョウバエモデルを選択します。ショウジョウバエのゲノムの進化の過程で非常に節約されたが、全体的にはるかに少ない遺伝子重複と代謝複雑さで、多くの人間の病気4に関与する基本的なメカニズムを理解するために理想的な小さい,7,8しますまた、脂肪組織、消化管によって特徴的なプロセスが実施と膵臓がフライで表され、人間9,に類似している糖・脂質代謝、たとえば、規制機能を仲介する。10,11。また、肥満、インスリン抵抗性や人間の糖尿病のコントロールに関与する基本的な分子経路はキイロショウジョウバエ12,13,14保存機能,15,16. 高等生物のようなショウジョウバエが哺乳類心臓3,17のそれに類似したプロセスによって開発中に形成される心臓の鼓動。したがって、プロトコルと高スループット タグ分析、ショウジョウバエの遺伝学的ツール ボックスを使用して有効なスクリーニング目的のために適応を供給信頼性の高い HFD の開発研究し、遺伝的基礎を理解するための重要な手段を提供します。複雑な代謝性疾患の基になります。
HFD 食品自体はほとんど18メタボリック シンドロームと関連付けられる知られている飽和脂肪酸で構成されているココナッツ オイルを添加した標準研究所はえの食糧から作られます。齧歯動物などの哺乳類モデルで肥満を誘発するヶ月19,20を取ることができる、私たちの最適化された HFD 効果的かつ再現性をもって、ショウジョウバエのプロトコルを供給増加の問題で個体の脂肪分日12,14。このプロトコルでは、タグの高スループット試金と組み合わせて効率的な検診遺伝的要因、環境の影響および脂肪質の新陳代謝の新しい変調器を発見する新薬候補の効果をことができます。その結果、これらのプロトコルは、理解や戦闘肥満および肥満関連人間の病理学に関連します。
餌のプロトコルは多目的、単一の飽和または不飽和の脂肪酸の代謝と機能の効果を研究に適用可能性があります。タグにあるこの高スループットの分析の使用、キイロショウジョウバエに限定されないが、キューティクルやタフな細胞外マトリックス (例えば、他のショウジョウバエの種、線虫と小さいモデル有機体の様々 な適応があります。およびその他の新興の無脊椎動物モデル) 代謝病期や成人期開発のあらゆる段階で異なる環境、遺伝的または生理学的な条件の下で脂肪の量を測定します。タグ アッセイは遊離脂肪酸、グリセロール、グリセロール 3-リン酸、最終的に 4-アミノアンチピリン (4-AAP) と 3, 5 – と反応して H2O2にタグが低下する酵素反応の一連の比色測定に基づいてジクロロ-2-ヒドロキシ ベンゼン スルホン酸 (3, 5 DHBS) 96 ウェルの分光光度計を用いて測定した赤い色の製品を生産します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウスの肥満誘導は、ヶ月19,20を取ることができます。ハエ、プロトコルを供給この HFD は日以内の 18 h (図 2を参照) 後にのみ脂肪蓄積の増加を引き起こしている問題で過剰の脂肪蓄積の誘導のことができます。HFD 説明プロトコルと餌はグルコース コンテンツ12を増加し、 Bmmリパーゼと PGC 1 式<sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はこの原稿を編集のエリカ ・ テイラーを感謝したいです。この作品は、国立衛生研究所 (P01 HL098053、P01 AG033561 および R01 HL054732) r. b. に、博士課程終了後の研究サプリメント (R01 HL085481) と親睦 (AAUW) から S.B.D.、助成金、S.B.D. に米国心臓協会からの助成金によって賄われていた・ R.T.B.
Materials
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
Referências
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