Høy fett diett fôring og høy gjennomstrømning Triacylglyceride analysen i Drosophila Melanogaster
Summary
Dette er en høy fett diett fôring protokollen for å indusere fedme i Drosophila, en modell for å forstå grunnleggende molekylære mekanismer involvert i lipotoxicity. Det gir også en høy gjennomstrømning triacylglyceride analysen for å måle fett ansamling i Drosophila og potensielt andre (insekter) modeller under ulike kosttilskudd, miljø, genetisk eller fysiologiske forhold.
Abstract
Hjertesykdom er den fremste dødsårsaken menneskelige verden. Mange studier har vist sterke koplinger mellom fedme og hjerte feil hos mennesker, men flere verktøy og forskningsinnsats er nødvendig for å bedre belyse mekanismene som er involvert. For over hundre har genetisk svært tett modell av Drosophila vært instrumental i oppdagelsen av viktige gener og molekylære veier som viste seg å være svært bevart tvers av arter. Mange biologiske prosesser og sykdom mekanismer er funksjonelt bevart i fly, som utvikling (f.eks, kroppen planen, hjerte), kreft og nevrodegenerative sykdommer. Nylig har studier av fedme og sekundære patologi, som for eksempel hjertesykdom i modellen organismer, spilt en svært viktig rolle i identifikasjon av viktige regulatorer involvert i Metabolsk syndrom hos mennesker.
Her foreslår vi bruke denne modellen organisme som et effektivt verktøy til å indusere fedme, dvs, overdreven fett ansamling og utvikle en effektiv protokoll for å overvåke fettinnhold i form av TAGs akkumulering. I tillegg til den høyt konservert, men mindre komplekse genom har fly også en kort levetid for rask eksperimentering, kombinert med kostnadseffektivitet. Dette dokumentet gir en detaljert protokoll for høy fett diett (HFD) fôring i Drosophila å indusere fedme og en høy gjennomstrømning triacylglyceride (TAG) analysen for å måle tilknyttede økningen i fettinnhold, med sikte på å være svært reproduserbare og effektiv for store genetiske eller kjemisk screening. Disse protokollene gir nye muligheter til effektivt undersøke regulatoriske mekanismer involvert i fedme, samt gi en standardisert plattform for drug discovery forskning for rask testing av effekten av narkotika kandidater på utvikling eller forebygging av fedme, diabetes og metabolske sykdommer.
Introduction
Vi er i en tid hvor fedme og dens tilknyttede økonomiske byrder, er et verdensomspennende problem1. To av tre amerikanere er overvektige eller fete med relaterte hjertet patologi, den primære dødsårsaken i den voksne befolkning2. Nye effektive metoder for å undersøke tilstrekkelig genetiske og molekylære komponentene innblandet i regulering av Metabolsk syndrom bruker modellen organismer. Derfor velger vi frukt fly Drosophila modellen fordi den deler de mest grunnleggende biologiske prosessene med pattedyr, inkludert mus og mennesker3,4,5,6. Drosophilagenom er høyt konservert under utviklingen, men samlet mye mindre med mindre genet duplisering og metabolske kompleksitet, gjør det ideelt for å forstå grunnleggende mekanismer involvert i mange menneskelige sykdommer4 , 7 , 8. også karakteristiske prosesser utført av fettvev, tarmen og bukspyttkjertel er representert i fly og megle regulatoriske funksjoner i glukose og lipid metabolisme, for eksempel som ligner på mennesker9, 10,11. Videre er de grunnleggende molekylære veiene involvert i kontrollen av fedme, insulinresistens og diabetes i mennesker funksjonelt bevart i Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. som høyere organismer, Drosophila har et bankende hjerte som er dannet under utviklingen av lignende prosesser som i pattedyr hjertet3,17. Dermed utviklingen av en pålitelig HFD fôring protokollen og høy gjennomstrømning TAG analysen, tilpasset for effektiv screening formål bruker genetisk verktøyet boksen Drosophila, gir et viktig middel for å studere og forstå grunnleggende genetisk grunnlag underliggende komplekse metabolske sykdommer.
HFD maten selv er laget av en standard laboratorium fly mat supplert med kokos olje, som består hovedsakelig av mettede fettsyrer som er kjent for å være assosiert med Metabolsk syndrom18. Mens inducing fedme hos pattedyr modeller, som gnagere, kan ta måneder19,20, øker våre optimalisert HFD fôring protokollen i Drosophila effektivt og reproduserbar organismebiologi fettinnhold i løpet av dager12,14. Denne protokollen, kan sammen med en høy gjennomstrømning TAG analysen, effektiv masse screening for virkningene av genetiske faktorer, miljøpåvirkning og narkotika kandidater å oppdage nye modulatorer av fettstoffskiftet. I følge disse protokollene er sannsynlig relevant å forstå og/eller combat fedme og overvekt-assosiert menneskelige patologi.
Fôring protokollen er allsidig og brukes til å studere metabolske og funksjonelle virkningene av enkelt mettede eller umettede fettsyrer. Bruk av denne høy gjennomstrømning TAG analysen er ikke begrenset til D. melanogaster, men kan tilpasses en rekke små modell organismer med cuticle eller tøff ekstracellulære matriser (f.eks, andre Drosophila arter, C. elegans og andre nye virvelløse modell organismer) å måle fettinnhold under ulike miljømessig og fysiologiske og genetiske forhold, av utvikling, voksen eller fase av metabolsk sykdom. TAG analysen er basert på en kolorimetrisk måling av en rekke enzymatiske reaksjoner som fornedre kodene til frie fettsyrer, glyserol, glyserol 3-fosfat og endelig H2O2 som reagerer med 4-aminoantipyrine (4-AAP) og 3,5- Dichloro-2-hydroxybenzene sulfonate (3,5 DHBS) å produsere en rød farget produkt som måles med en 96-brønns spektrofotometeret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fedme induksjon i mus kan ta måneder19,20. Fluer kan denne HFD fôring protokollen for induksjon av overflødig fett ansamling i løpet av dager eller mindre, noe som øker i fett ansamling etter 18 h (se figur 2). HFD fôring med beskrevet protokollen øker glukose innhold 12 og reduserer Bmm lipase og PGC-1 uttrykk24. Dette er fasting av voksen Drosophila som fører…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Erika Taylor for redigering dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra den National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 og R01 HL054732) å R.B., en post-doc forskning supplement (R01 HL085481) og fellesskap (AAUW) til S.B.D., og tilskudd fra American Heart Association til S.B.D. og R.T.B.
Materials
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
Referências
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015)
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genética. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
