Análise cinemática da marcha no plano sagital produz informações altamente precisas sobre como o movimento é executado. Descrevemos a aplicação destas técnicas para identificar déficits da marcha de ratos submetidos a desmielinização mediada por doença auto-imune. Esses métodos também podem ser usados para caracterizar os déficits da marcha para outros modelos de rato com locomoção prejudicada.
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Artigo de método
Análise cinemática da marcha de sagital em camundongos C57BL/6 sujeitado a MOG35-55 induzido encefalomielite auto-imune Experimental
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Análise cinemática da marcha no plano sagital frequentemente tem sido usado para caracterizar o déficit motor em esclerose múltipla (MS). Descrevemos a aplicação destas técnicas para identificar déficits da marcha em um modelo do rato do MS, conhecido como encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Défices de paralisia e motor em ratos submetidos a EAE normalmente são avaliados usando uma escala de Pontuação clínica. No entanto, esta escala produz somente dados ordinais que fornece pouca informação acerca da natureza exacta dos défices motor. Severidade da doença EAE também tenha sido avaliada por desempenho rotarod, que fornece uma medida de coordenação motora geral. Por outro lado, análise cinemática da marcha do membro posterior no plano sagital gera informações altamente precisas sobre como o movimento é prejudicado. Para executar este procedimento, marcadores reflexivos são colocados em um membro posterior para detectar movimento comum, enquanto que um rato está caminhando em uma esteira. Software de análise de movimento é usado para medir o movimento dos marcadores durante a caminhada. Parâmetros cinemáticos da marcha em seguida são derivados de dados resultantes. Mostramos como esses parâmetros da marcha podem ser usados para quantificar movimentos prejudicados das articulações do tornozelo, joelho e quadril na EAE. Estas técnicas podem ser usadas para melhor compreender os mecanismos da doença e identificar potenciais tratamentos para MS e outras doenças neurodegenerativas que afectar a mobilidade.
Introdução
Marcha é uma série de movimentos repetitivos dos membros utilizados para alcançar a locomoção. Marcha é composta por ciclos de passo, que são divididos em duas fases: a fase de postura, que é quando o pé está se movendo para trás no chão para impulsionar o corpo para a frente; e a fase de balanço, onde o pé está fora o chão e se movendo para a frente. Distúrbios da marcha são características da marca registrada de muitas doenças neurodegenerativas, tais como a lesão da medula espinhal (SCI), esclerose múltipla (em), esclerose lateral amiotrófica (ela), doença de Parkinson (PD) e acidente vascular cerebral; modelos pré-clínicos de roedores destes transtornos frequentemente recapitular sua marcha respectivas imparidades1. Os mecanismos de controle básico de locomoção em camundongos têm sido intensamente estudados2,3. Além disso, existem modelos de rato de muitos distúrbios neurológicos humana4. Análise de marcha em ratos é, portanto, uma abordagem atraente para medir vários aspectos dos défices de motor que tem conhecido correlações anatômicas. O estudo da marcha em modelos do rato pode fornecer insights sobre as bases neuropatológicas dos défices locomotoras em doenças neurodegenerativas e possibilitam a identificação de potenciais tratamentos.
Algumas técnicas que foram usadas para medir a marcha em roedores incluem inspeção visual (por exemplo, o Basso rato escala5 e teste de campo aberto6) e análise da marcha da ventral avião7. Mais recentemente, métodos para medir sagital cinemática dos movimentos do membro posterior ganharam popularidade, porque eles fornecem mais informações sobre a execução do movimento e, consequentemente, são mais sensíveis às mudanças sutis em marcha8, 9 , 10 , 11. cinemáticas técnicas desenvolvidas para estudar o movimento do membro posterior no plano sagital durante a caminhada em uma esteira,9,12 têm sido muito estudadas no contexto da SCI, ALS, lesões traumáticas corticais, acidente vascular cerebral, e A doença de Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Em contraste, estas técnicas têm visto o uso limitado no estudo do aparelho locomotoras défices para modelos de rato de esclerose múltipla17.
Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é o modelo do MS18rato mais comumente usados. Os dois principais métodos de induzir EAE é através de inoculação de ativa ou passiva. Em EAE ativo, os ratos são imunizados com antígenos da mielina, causando neuroinflammation de mediada por células T auto-reativas e desmielinização na medula espinhal e cerebelo. EAE passiva, por outro lado, é induzida pela transferência de células auto-reativas T de um mouse com EAE ativo para um ingênuo rato19. Conforme descrito em outro lugar, o curso da doença e neuropatologia são influenciados por antígenos do sistema nervoso central (SNC) e rato Coe20,21,22,23,24 ,25. Em experimentos EAE, controle de ratos são injetados com completa adjutor de Freund (CFA) sem o antígeno de mielina. EAE é caracterizada pela crescente paralisia que começa com fraqueza de cauda e potencialmente pode envolver os membros dianteiros, resultando em ataxia e paralisia20. Nós recentemente têm caracterizado as mudanças de marcha em camundongos C57Bl/6 sujeitados a glicoproteína de mielina oligodendrocyte 35-55 (MOG35-55)-induzido EAE. Estes estudos mostraram-se análise de marcha ser superior do que a clássica análise comportamental porque desvios do movimento normal do tornozelo são altamente correlacionados com o grau de perda de substância branca na medula espinhal lombar de EAE ratos26. Por outro lado, a força da correlação entre perda de substância branca e duas outras medidas comportamentais tradicionais (marcando clínicos e rotarod) foi muito mais fraco26.
Descrevemos aqui a utilização da análise cinemática da marcha para detectar déficits de movimento no plano sagital de ratos EAE andando em uma esteira. Cinco marcadores reflexivos foram colocados em um membro posterior para identificar o movimento de quadril, joelho e articulações do tornozelo em gravações de vídeo de alta velocidade. Software de análise de movimento foi usado para extrair dados cinemáticos sobre excursões conjuntas. A utilidade destas técnicas para quantificar os défices de movimento para o modelo de35-55 MOG da EAE são discutidos. Essas técnicas também são aplicáveis para o estudo de déficits da marcha em outros modelos de rato de doenças neurodegenerativas.
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Protocolo
este protocolo está de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal e foi aprovado pelo Comitê de Universidade de Dalhousie, em animais de laboratório.
1. construir marcadores reflexivos:
- usando um furador Hand-Held, socar o número desejado de pequenos círculos de uma folha de papel reflexivo. Cada animal requer 5 marcadores para uma única gravação; dois grandes e três pequenos marcadores.
- Com uma tesoura bem, fazer um corte reto, estendendo-se desde o perímetro ao centro do círculo.
- Remover a película protectora do marcador para revelar a superfície adesiva. Usando a pinça fina, segure o marcador firmemente e enrolar--em si mesma usando o dedo para formar uma forma de cone. Para que um pequeno marcador, enrolar o cone firmemente. Para que um grande marcador, enrolar o cone vagamente.
- Usando uma pistola de cola à mão, preencher o interior do marcador em forma de cone com cola enquanto segurando a ponta do cone com fórceps e aderir o marcador de um simples pedaço de papelão. A cola irá impedir que o marcador de colapso e dobra durante a gravação para garantir ótima reflexão de luz. Quando é a cola secar (aproximadamente 10 min), remover o marcador de papelão com um bisturi ( figura 1A).
2. Preparar o Animal para a gravação
- Anesthetize o mouse com gás de isoflurano (2,5%; 2 litros/min O 2), colocando o mouse em uma câmara de indução. Quando o mouse estiver inconsciente, coloque-o em um cone de nariz posicionado em cima de uma manta de aquecimento de água de recirculação. O objetivo da anesthetization é imobilizar o mouse para a colocação do marcador; o procedimento não é doloroso. Portanto, a profundidade da anestesia não precisa ser avaliado.
- Aplicar um lubrificante tópico olho para ambos os olhos.
- Raspar o membro desejado posterior usando tosquiadeiras elétricas. Começar no tornozelo e estender a coluna vertebral e a parte inferior das costelas; Certifique-se de nenhuma pele é deixada como isto prejudicará a adesão de marcador.
Nota: Aqui, o membro posterior direito foi gravado; no entanto, que pode ser usado de qualquer membro posterior. - Usando um marcador permanente, indicar a localização da crista ilíaca e a articulação do quadril. A crista ilíaca é logo abaixo da parte inferior das costelas e é facilmente palpável, reunindo os joelhos sob o mouse ' corpo de s.
Nota: A articulação do quadril pode ser encontrada por flexionando e estendendo a perna para encontrar o ponto de articulação entre o fêmur e pelve. - Usando a pinça fina, segure a ponta afiada de um pequeno marcador e mergulhe a base de cola de adesivo de ação rápida, ou uma alternativa equivalente. Coloque o marcador na ponta do quarto dígito e segurar no lugar para 2-3 s permitir que a cola secar. Coloque os outros dois pequenos marcadores na articulação metatarsofalângica e tornozelo da mesma maneira ( figura 1B).
- Coloque marcadores grandes sobre a crista ilíaca e a articulação do quadril ( figura 1B), da mesma forma como os pequenos marcadores.
- Remover o mouse do cone do nariz e transferir imediatamente para a sala de gravação utilizando uma gaiola de transferência. Posicione o mouse na escada rolante estacionária e permitir a recuperação completa da anestesia.
3. Gravação de marcha
- antes de gravar o mouse ' marcha s, tire uma foto de um bloco de calibração com dimensões conhecidas na esteira.
Nota: Isto permitirá que os pixels do vídeo a ser convertido em medições reais. A câmera deve ser colocada a cerca de 120 cm da esteira.- Posição da câmera na mesma altura e nível, como a esteira. Manter a mesma posição da câmera para as gravações a seguir a imagem de calibração.
- Uma vez que o mouse se recuperou totalmente de anestesia, transformar a esteira de baixa velocidade (5 cm/s) para deixar o rato começar a andar. Certifique-se de que a direção de correia de esteira é tal que os marcadores do mouse estão virada para a câmera.
- Aumento da esteira velocidade gradualmente até 20 cm/s; isto é a velocidade ideal para uma marcha consistente em camundongos mais saudáveis.
Nota: Embora o ideal é ter todos os ratos andando na mesma velocidade, alguns podem ser consistentemente cheguem a esta velocidade.- Se o mouse é incapaz de andar a 20 cm/s, reduz a velocidade conforme necessário e não se esqueça de tomar nota disto. Reduzir a velocidade da esteira até passo consistente ciclos são alcançados.
Nota: Análise de dados posterior pode ajustar para diferenças de velocidades.
- Se o mouse é incapaz de andar a 20 cm/s, reduz a velocidade conforme necessário e não se esqueça de tomar nota disto. Reduzir a velocidade da esteira até passo consistente ciclos são alcançados.
- Begin, gravar o vídeo, uma vez que o mouse é andar constantemente (ou seja, andando em um ritmo consistente, não criação ou tecelagem para os lados). Continue gravando até 8 a 12 ciclos de passo consecutivos foram registrados. Para cada vídeo, registro da velocidade da esteira e do lado do mouse gravado.
- , Uma vez que a gravação estiver concluída, desligar a esteira e retornar o mouse para sua gaiola. Limpe a esteira completamente entre gravações como perfumes deixados para trás por outros ratos podem alterar o comportamento dos ratos de entrada. Para reduzir o stress e danos de pele, não remova os marcadores; permitir que os ratos para removê-los por conta própria.
4. Análise
- processar os vídeos usando o software de análise de movimento.
Nota: Em nossas experiências, usamos scripts personalizados projetados para software da imagem latente e estatístico (ver Tabela de materiais) que foram escritas pelo Dr. Nicolas Stifani. As seguintes etapas são executadas usando o software de análise de movimento selecionado.- Extrair as coordenadas de pixel dos marcadores de vídeos e usando o vídeo de calibração, transformar os valores de pixel para centímetros e calcular os ângulos articulares em cada frame.
- Identificar o início e fim de cada ciclo de passo, obtendo assim, informações sobre a etapa duração e.
- Normalizar a etapa duração de ciclo para 200 quadros normalizados, tal que o balanço e a postura são representados por 100 frames, respectivamente.
- Usando os quadros normalizados, calcular Parâmetros cinemáticos para análise de dados usando o software de planilha (ver Tabela de materiais).
- Para estabelecer o ângulo médio de uma determinada articulação, tomar a média de todos os ângulos, dentro de um quadro normalizado como:
Nota: aqui o x representa o valor do ângulo em uma dada normalizado frame e n representa o número de quadro normalizado. - Para estabelecer a amplitude de movimento de uma articulação específica para um determinado mouse, subtrair o menor ângulo entre o maior ângulo em um conjunto de quadros normalizados da seguinte forma:
Amplitude de movimento = ângulo máximo - ângulo mínimo.
Nota: Aqui o ângulo máximo e mínimo ângulo são os ângulos maiores e menores, alcançados no âmbito do ciclo de passo normalizado, respectivamente. - Para estabelecer a diferença de RMS, primeiro subtrair o ângulo médio de cada tempo experimental-ponto da gravação de base. Em seguida, quadrado cada diferença, tomar a média dos valores tudo quadrado e a raiz quadrada da média. A equação é a seguinte:
Nota: aqui
representa o ângulo médio da linha de base de gravação; y representa o ângulo médio de cada ponto de tempo experimental; n e representa o número de quadros normalizados. Raiz significa a diferença de quadrados (RMS) é uma medida utilizada para avaliar o desvio em marcha de gravações de base.
- Para estabelecer o ângulo médio de uma determinada articulação, tomar a média de todos os ângulos, dentro de um quadro normalizado como:
- Usar gráficos científicos e software de estatísticas para analisar e apresentar os dados (ver Tabela de materiais).
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Resultados
A Figura 1 é uma representação esquemática do procedimento utilizado para a análise cinemática da marcha. Primeiros, reflexivos marcadores são feitos e colocados em um mouse em 5 pontos anatômicos. Marcha é então gravada enquanto o mouse está caminhando em uma esteira. Software de análise de movimento é usado para extrair dados cinemáticos para análise posterior.
Figura 2A C representar o ciclo do passo de um rato CFA...
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Discussão
Em camundongos com EAE, os dois métodos mais comuns de medir o déficit motor estão marcando clínicos em cair a latência de um rotarod27,28. Estas técnicas têm várias limitações. Apesar de conveniente e amplamente utilizado, marcando clínica é limitada pela rendendo apenas ordinais dados nível, significando que a magnitude das diferenças entre os escores clínicos não são conhecidos. Clínica de Pontuação também sofre de ser incapaz de fornecer informações precisas ...
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Divulgações
Os autores declaram que eles não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Nós gostaríamos de reconhecer Sid Chedrawe para sua assistência técnica com as filmagens. Este trabalho foi financiado por fundos da MS Society do Canadá (EGID 2983).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Câmera | Nikon | Nikon D750 | Usado para filmar o vídeo |
| Fita reflexiva | B& L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Tesoura fina | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Fórceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pistola de cola | Craftsmart | E231647 | |
| cabo de bisturi # 4 | Roboz | R5-9884 | |
| Lâmina de bisturi No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL / 6 ratos | Charles River Laboratories | ||
| EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | ||
| Manta de aquecimento de água de recirculação | Androit | HTP-1500 | |
| lubrificante ocular tópico | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| Câmera de alta velocidade | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| Luz de alta potência | Smith Victor Corporation | Modelo 700 SG (luz de quartzo de 600 Watts, 120 Volts) | |
| Suporte de Luz | Promaster | LS1 | |
| Esteira | Construída sob medida no Instituto Zoológico, Universidade de Colônia | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Versão 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | Este é um script gerado para uso com ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | Este é um script gerado para uso com Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Versão 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Versão 6.00 |
Referências
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Reimpressões e permissões
