Evaluación de la Homeostasis dopaminérgica en ratones por medio de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento y absorción de la dopamina Synaptosomal
Summary
Absorción de la dopamina Synaptosomal y cromatografía líquida de alto rendimiento representan experimental las herramientas de análisis para investigar la homeostasis de la dopamina en ratones mediante la evaluación de la función de transportador de la dopamina y los niveles de dopamina en el tejido estriado, respectivamente. Aquí presentamos los protocolos para medir contenido de tejido de dopamina y evaluar la funcionalidad del transportador de dopamina.
Abstract
Dopamina (DA) es un neurotransmisor modulador controla la actividad motora, los procesos de recompensa y la función cognitiva. Deterioro de la neurotransmisión dopaminérgica (DAergic) está fuertemente asociado con varias enfermedades asociadas del sistema nervioso central como la enfermedad de Parkinson, trastorno de hiperactividad de déficit de atención y adicción de drogas1,2 ,3,4. Delinear los mecanismos de la enfermedad que implica desequilibrio DA es críticamente dependiente de modelos animales para imitar los aspectos de las enfermedades, y así protocolos que evalúan las partes específicas de la homeostasis de la DA son importantes para proporcionar nuevos conocimientos y posible terapéutica objetivos para estas enfermedades.
Aquí, presentamos dos protocolos experimentales útiles que al combinarse proporcionan datos funcionales sobre el sistema de DAergic en ratones. Parámetros bioquímicos y funcionales en la homeostasis de la DA se obtienen a través de la evaluación de los niveles de DA y dopamina transportador (DAT) funcionalidad5. El sistema DA la investigación, la capacidad para medir confiablemente los niveles endógenos de DA del cerebro adulto es esencial. Por lo tanto, presentamos cómo realizar la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en tejido cerebral de los ratones para determinar niveles de DA. Realizamos el experimento en el tejido estriado dorsal (dStr) y Núcleo accumbens (NAc), pero el método es también adecuado para otras áreas del cerebro DA inervados.
DAT es esencial para la recaptación de DA en la terminal presináptica, así control de la actividad temporal y espacial de DA. liberado Conocer los niveles y funciones de DAT en el cuerpo estriado es de gran importancia cuando se evalúan DA homeostasis. Presentamos un protocolo que permite deducir simultáneamente información sobre niveles de superficie y la función usando un análisis de absorción de synaptosomal6 DA.
Los métodos actuales combinados con protocolos estándar immunoblotting proporcionan el investigador con las herramientas pertinentes para caracterizar el sistema de DAergic.
Introduction
Dopamina (DA) es un neurotransmisor modulador fundamental de comportamiento motor, recompensa y función cognitiva1,7,8,9. Los desequilibrios en la homeostasis de DA están implicados en varias enfermedades neuropsiquiátricas tales como trastorno por déficit de atención con hiperactividad, la adicción a las drogas, la depresión y la enfermedad de Parkinson1. DA se libera desde la neurona presináptica a la hendidura sináptica, donde ata a y activa los receptores en la membrana pre y postsináptica, transmitir aún más la señal. El nivel de DA en la sinapsis después de liberación es espacial y temporalmente controlada por DAT3,10. El transportador secuestra DA desde el espacio extracelular y así sostiene fisiológico DA niveles3,11. Supresión genética de DAT en ratones provoca un fenotipo de hiperdopaminérgicos caracterizado por elevados niveles de DA sinápticos, agotamiento de piscinas DA intracelulares y cambios profundos en postsynaptic DAergic señalización10,12.
Aquí, se presentan dos protocolos separados, un método a medida DA tejido contenido y otro para evaluar la funcionalidad de DAT. combinado con el ensayo de Biotinilación superficial descrito por Gabriel et al.13 estos dos métodos proporcionan información en DA niveles de contenido y funcionales de DAT para una evaluación cuidadosa de la homeostasis de la DA. Con estos métodos DA homeostasis de varios ratones transgénicos o modelos de la enfermedad puede ser caracterizada y descrita. Estas herramientas se han implementado y optimizado y son de uso estándar en nuestros laboratorios. Ensayos actuales han servido para investigar las consecuencias sobre la homeostasis de DA de alterar el C-terminal de DAT14 o expresando recombinase de Cre en la tirosina hidroxilasa (TH) promotor 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito describe protocolos experimentales útiles para delinear DA homeostasis en cualquier modelo de ratón de elección. Ofrecemos protocolos detallados para medir los niveles de DA en el tejido cerebral de ratones utilizando HPLC y synaptosomal DA captación para evaluar funcional DA transporte a través de DAT. Los procedimientos, protocolos y límites para el experimento HPLC y análisis de absorción DA synaptosomal serán elaborados por debajo.
El protocolo de captación synapt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la UCPH 2016 programa de excelencia (U.G., A.R., K.J.), la Fundación Lundbeck (M.R.) centro de la Fundación Lundbeck para biomembranas en nanomedicina (U.G.), el nacional Instituto de salud subvenciones P01 DA 12408 (U.G.), el danés Consejo para la investigación independiente – ciencias médicas (U.G.).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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