Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature
Summary
Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per la valutazione imparziale stereologiche dei numeri di un neurone delle cellule dopaminergiche nel nigra di substantia del mouse utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, un microscopio ottico, una tabella di oggetto motorizzato (x, y, z aereo) e software di pubblico dominio per analisi digitale delle immagini.
Abstract
Nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson, analisi del tratto nigrostriatal, compresa la quantificazione di perdita di neuroni dopaminergici nel nigra di substantia, è essenziale. Per stimare il numero di neuroni dopaminergici totale, imparziale stereology utilizzando il metodo ottico frazionatore è attualmente considerato il gold standard. Poiché la teoria dietro il metodo ottico frazionatore è complessa e stereology è difficile da raggiungere senza attrezzature specializzate, esistono vari sistemi commercialmente disponibili stereology completi che includono il software necessario, puramente per cella contando i motivi. Dal momento che l’acquisto di un setup stereology specializzato non è sempre fattibile, per molte ragioni, questo rapporto descrive un metodo per la stima stereologiche del cellulare di un neurone dopaminergico conteggi mediante microscopia standard attrezzature, compreso un microscopio ottico, un tavola di oggetto (x, y, z aereo) motorizzata con software di imaging e un computer per l’analisi. È dato una spiegazione dettagliata su come eseguire stereologiche quantificazione mediante il metodo ottico frazionatore, e file di pre-programmati per il calcolo dei conteggi delle cellule stimato vengono forniti. Per valutare la precisione di questo metodo, è stato effettuato un confronto con i dati ottenuti da un apparato di stereology commercialmente disponibili. Numeri paragonabili delle cellule sono stati trovati usando questo protocollo e il dispositivo stereology, dimostrando così la precisione di questo protocollo per stereology imparziali.
Introduction
La quantificazione del numero di cellulare di un neurone è fondamentale nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson per determinare il livello della neurodegenerazione nel nigra di substantia (SN)1,2. La valutazione imparziale stereologiche del numero delle cellule in una regione di interesse è considerata il gold standard3,4,5.
Prima dell’avvento di stereology imparziale, il numero dei neuroni nelle sezioni è stato valutato mediante la manipolazione delle cellule contate profili per correggere le probabilità variabile che neuroni entrano in vista in una sezione. Uno dei metodi più comunemente usati era la correzione dell’emocromo quantificati descritto da Abercrombie6. Questo metodo ha tentato di prendere in considerazione che le cellule possono essere quantificate in più di una volta se frammenti della stessa cella si trovano nelle sezioni sottili adiacenti. Di conseguenza, Abercrombie e altri autori generato equazioni che ha richiesto le ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate7,8. Tuttavia, questi presupposti erano solitamente non realizzati e quindi portati a errori sistematici e divergenza dal numero effettivo della cella (cioè, polarizzazione). Inoltre, il bias non potrebbe essere ridotto di campionamento supplementare3.
Per la stima stereologiche di numeri di cellulare usando il frazionatore ottico, principi matematici sono applicati per valutare direttamente i numeri di cellulare direttamente in un volume definito, 3-dimensionale. Il vantaggio di questo metodo è che non comporta ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate. Così, i numeri di cellulare stimato sono più vicini ai valori true e avvicinarsi man mano che aumenta la dimensione del campione (cioè, imparziali)3. Perché molte regole devono essere seguite quando usando stereology per mantenere il metodo imparziale, sono stati sviluppati sistemi di ready-to-use commerciale stereology (per la revisione, Vedi Schmitz e Hof, 2005,4). Sistemi specializzati stereology implementano metodi stereologiche basati su progettazione con aprioristicamente definite sonde e sistemi di campionamento per le valutazioni stereologiche che portano all’indipendenza dalla forma, dimensione, distribuzione spaziale e orientamento della cellule per essere analizzati4,9. Tuttavia, i sistemi di stereology commercialmente disponibili sono costosi; Questo potrebbe limitare implementazione nella ricerca di nuove.
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare una tecnica utilizzabile per la stima stereologiche basati su progettazione della conta delle cellule dopaminergiche nel topo SN, impiegando il metodo ottico frazionatore e utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, luce microscopio, microscopio standard software e un motorizzato x, y, z fase). Per questo, è presentata una guida passo passo su come elaborare del tessuto di cervello di topo e come stimare i numeri di cell SN utilizzando stereology imparziali basati su progettazione. Inoltre, sono disponibili modelli per il calcolo dei numeri di cellulare stimato e coefficienti di errore (CE).
Il metodo qui descritto non è limitato all’analisi dello SN, ma può essere adattato per l’uso in altre regioni anatomicamente definite del cervello di topo o ratto. Per esempio, stereology imparziale è stato utilizzato per stimare i numeri di cellulare di un neurone l’ ippocampo10 e il locus coeruleus11. Inoltre, tipi cellulari diversi da neuroni, astrociti12 e microglia13, possono essere valutati come bene. Pertanto, questo metodo può essere utile agli scienziati che intendono attuare stereology imparziale nella loro ricerca, ma non sono disposti a spendere un sacco di soldi per l’acquisto di un sistema di ansia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology inizia con lavorazione del tessuto. Il taglio seriale del tessuto SN deve essere eseguito con attenzione per evitare la perdita delle sezioni durante l’analisi STEREOLOGICHE. Inoltre, un passo essenziale consiste nel contrassegnare un emisfero al fine di distinguere la destra dalla sinistra SN durante l’esecuzione di ansia. Immissione di un piccolo foro nella parte superiore del tronco cerebrale generato i risultati migliori nello studio presentato. Inoltre, dal lavorare con le esigenze di metodo frazionatore …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati a Keali Röhm, Louisa Frieß e Heike Menzel per loro assistenza tecnica; a Helga Brünner per la cura degli animali; e a Chistopher S. Ward per la generazione e la distribuzione del disector ottico griglia plugin per il software ImageJ.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
Referências
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neurociência. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neurociência. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
