该协议描述了大鼠源性瓣膜间质细胞的分离、培养和钙化, 这是一种高度生理学的钙化主动脉瓣病变 (CAVD) 的体外模型。这种大鼠模型的开发有助于 CAVD 研究的细胞和分子机制的基础, 这一复杂的病理过程。
钙化主动脉瓣疾病 (CAVD) 的特点是逐渐增厚的主动脉瓣小叶。这是一个常见的情况下, 老年人和终末期肾病 (末期) 患者, 谁通常患有高和钙。目前, 没有药物治疗可以阻止其进展。这种病理过程的机制仍然不清楚。主动脉瓣小叶是由一薄层的瓣膜内皮细胞 (内皮) 在外表面的主动脉尖, 与阀间细胞 (受害者) 夹在内皮。使用大鼠模型可以使体外研究的异位钙化的基础上的体内生理血清磷酸盐 (Pi) 和钙 (Ca) 水平的病人谁患有高和钙。所描述的协议详述了一个纯鼠 vic 种群的分离, 表现为 vic 标志物: α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 波形和组织生长因子β (TGFβ) 1 和 2, 并没有分化 (CD) 31, VEC标记.通过扩大这些受害者, 生物化学, 遗传学和成像研究可以进行研究和解开的关键调解人托 CAVD。
健康的主动脉瓣由三张小叶组成, 在阀门开闭的过程中, 机械应力的分布是相等的。该阀的小叶有一个定义的结构三不同的层: 丽, 质, 和 ventricularis, 其中房子阀间质细胞 (受害者) 的主要细胞类型。这三层是夹在两个床的瓣膜内皮细胞 (内皮)1。
在钙化主动脉瓣钙化 (CAVD) 的进展中, 受害者在西方世界最常见的心脏瓣膜疾病中起着至关重要的作用。CAVD 被描述为一个渐进的条件, 积极调节的心脏瓣膜组织及其周围微环境。细胞改变最初导致纤维化增厚, 并最终广泛钙化的主动脉瓣小叶。这就导致了严重的主动脉瓣狭窄和最终, 左心室流出梗阻2, 使手术瓣膜置换术成为唯一可行的治疗方法。
CAVD 的病理生理学是复杂的, 但与生理骨矿化的相似机制3。虽然, 一些研究表明, 受害者的能力进行成骨分化和钙化4,5, 支持此过程的机制尚未完全阐明, 突出显示CAVD 的一个可行的和相关的体外模型的关键要求。
以前的工作由许多实验室成功地隔绝了猪和牛模型的受害者, 并且培养了这些细胞在钙化情况下6,7,8。由于主动脉瓣在这些模型中的大尺寸, 通过酶消化分离细胞是非常有效的产生纯细胞群体。然而, 由于大型动物种类的分子工具有限, 这些模型可能会受到限制。相比之下, 啮齿动物模型仍然是有利的, 因为相对较低的成本, 潜在的遗传操作, 以及广泛的分子工具, 是现成的。然而, 从小动物模型中分离出的受害者并没有被广泛使用, 这很可能是在使用小组织标本时遇到的困难的结果。
这份详细的协议报告了一个全面的方法直接隔离大鼠受害者。通过仔细解剖的阀门, 其次是一系列的酶消解, 受害者可以孤立和就业的各种实验技术, 包括细胞培养, 钙化, 和基因表达。这种高度相关的体外模型 CAVD 无疑将对提高我们对这个病理过程的认识做出重要贡献。
这一详细的协议描述了一个实际的方法, 以获取主要的大鼠受害者, 使这些细胞从大鼠心脏瓣膜分离酶消化。我们的方法进一步支持和扩大了使用以前报道的大鼠体外模型研究主动脉瓣钙化13。从主动脉瓣膜中分离出的受害者会带来邻近内皮的潜在污染。然而, 我们的免疫荧光数据证实, 初步消化步骤足以消除内皮, 呈现孤立细胞阴性的内皮细胞标记, CD31。此外, α-SMA 染色证实了受害者的活化表型, 这是钙化12所必需的。
维克隔离以前曾在大型动物模型中报告过6,7,8。然而, 这些物种受到有限的遗传和分子工具的限制, 可用于下游研究, 以及它们在世界各地的实验室限制可及性。相比之下, 这种工具在现成的啮齿类动物中得到了很好的建立, 因此, 分离鼠源性受害者的能力使得实验设计能力更强。使用幼鼠的受害者也意味着细胞相对较年长的老鼠更具增殖性, 因此需要较少的动物来产生更多的细胞。虽然小鼠容易接近, 但由于小鼠有明显较小的心脏, 原鼠受害者的隔离将是更费时和相当多的动物将需要隔离相同的细胞产量作为大鼠模型。
这种方法的一个显著优点是, 可以从野外和转基因大鼠, 以及心血管疾病和瓣膜损伤的大鼠模型中分离出受害者。使用大鼠模型将需要大量的动物进行大规模的实验, 因此为了减少动物的使用, 原鼠的受害者可以转化成一个细胞系, 一旦它的特征。
虽然 CAVD 的严重临床影响被广泛承认, 但潜在的致病机制尚未确定。此外, 目前还没有有效的药物治疗方法, 可以预防和潜在治疗主动脉瓣钙化。因此, 在钙化条件下的受害者的文化提供了一个高度相关的体外模型的 CAVD。我们表明, 升高的钙和 Pi 水平诱导的体外孤立大鼠的钙化与相应增加的表达成骨基因标记Msx2, Alpl, 和Phospho1。广泛证实这些标记物与血管钙化的病理过程有关14,15,16。因此, 我们的数据表明, 钙化培养基中大鼠的培养是研究主动脉瓣钙化的合适模型。事实上, 我们的实验室最近的研究已经利用这个模型来证明, 钙促进主动脉瓣钙化通过蛋白 VI 丰富的 VIC 衍生基质囊泡17。
尽管使用大鼠受害者的好处和他们的有效表征, 仍然存在一些局限性。首先, 在大鼠瓣膜中, VIC 的数量是非常小的, 因此需要许多动物来产生足够的细胞数, 以供广泛的体外研究。然而, 有可能克服这一限制, 对永生化阀间质细胞系进行初步研究, 如最近美国的18报告, 并随后使用主要的文化来验证和扩展这些发现。
总之, 所描述的方法解释了成功的分离, 培养, 和钙化的原发大鼠, 可随后评估使用各种分析, 包括生物化学的化验, 以及蛋白质和 RNA 分析。该模型提供了一个可靠和方便的系统, 以调查 CAVD 的在体外, 并提供了一个有价值的工具, 调查的分子机制, 负责这种破坏性疾病。
The authors have nothing to disclose.
CD31 抗体是一个慷慨的礼物从 Dr., 爱丁堡大学卡伦谭。这项研究得到了生物技术和生物科学研究理事会 (BBSRC) 以研究所战略方案赠款 (BB/J004316/1) 的形式提供的资助;BBS/E/D/20221657) (VEM 和 CF), 学院职业道路奖学金 BB/F023928/1 (VEM) 和李兆基的资金通过 BBSRC 案例李兆基 BB/K011618/1 (LC)。
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
Spring curved (14 cm) | World Precision Instruments | 14112 | Autoclave before use. |
Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
SuperFine Vannas scissors (3 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 501778 | Autoclave before use. |
Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
Triton X100 | Sigma | X100 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera set up for Alizarin red images: | |||
Camera | Nikon D800 | ||
Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED |