इस प्रोटोकॉल अलगाव, संस्कृति का वर्णन है, और चूहे के कड़ा वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं, calcific महाधमनी वाल्व रोग (CAVD) के इन विट्रो में एक उच्च शारीरिक व्युत्पंन । इस चूहे मॉडल का शोषण कोशिका और आणविक तंत्र है कि इस जटिल रोग प्रक्रिया आबाद की खोज में CAVD अनुसंधान की सुविधा ।
Calcific महाधमनी वाल्व रोग (CAVD) महाधमनी वाल्व पत्रक के प्रगतिशील और अधिक मोटा होना की विशेषता है । यह एक शर्त अक्सर बुजुर्ग और अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ESRD) रोगियों, जो सामांयतः hyperphosphatemia और अतिकैल्शियमरक्तता से पीड़ित में पाया जाता है । वर्तमान में, कोई दवा उपचार है कि इसकी प्रगति को रोक सकता है । तंत्र है कि इस रोग की प्रक्रिया आबाद अस्पष्ट रहते हैं । महाधमनी वाल्व पत्रक महाधमनी cusps की बाहरी सतहों पर वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs) की एक पतली परत से बना है, वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं के साथ (VICs) VECs के बीच सैंडविच । एक चूहे के मॉडल का उपयोग vivo physiopathological सीरम फॉस्फेट (Pi) और hyperphosphatemia और अतिकैल्शियमरक्तता से पीड़ित रोगियों के कैल्शियम (सीए) के स्तर पर आधारित अस्थानिक कड़ा के इन विट्रो अध्ययन में सक्षम बनाता है । वर्णित प्रोटोकॉल के रूप में एक शुद्ध चूहा विक जनसंख्या के अलगाव के रूप में विक मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा दिखाए गए विवरण: अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) vimentin और ऊतक विकास कारक बीटा (TGFβ) 1 और 2, और भेदभाव के क्लस्टर के अभाव (सीडी) 31, एक VEC मार्कर. इन VICs का विस्तार करके, जैव रासायनिक, आनुवंशिक, और इमेजिंग अध्ययन के लिए अध्ययन और प्रमुख मध्यस्थों underpinning CAVD सुलझाया जा सकता है ।
स्वस्थ महाधमनी वाल्व तीन पुस्तिकाओं, जो खोलने और वाल्व के समापन के दौरान यांत्रिक तनाव का वितरण समान रूप से बांटा गया है शामिल है । वाल्व पुस्तिका तीन अलग परतों की एक परिभाषित संरचना है: fibrosa, spongiosa, और ventricularis, प्रमुख कोशिका प्रकार के रूप में जो घर वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं (VICs) । ये तीन परतें वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs)1के दो बिस्तरों के बीच सैंडविच हैं ।
VICs Calcific महाधमनी वाल्व कड़ा (CAVD), पश्चिमी दुनिया में सबसे आम हृदय वाल्व रोग की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । CAVD एक प्रगतिशील शर्त है कि सक्रिय रूप से वाल्वुलर ऊतक और उसके आसपास के microenvironment द्वारा विनियमित है के रूप में वर्णित है । सेलुलर परिवर्तन शुरू में fibrotic और अधिक मोटा होना कारण, और अंततः महाधमनी वाल्व पत्रक के एक व्यापक कड़ा । यह तो महत्वपूर्ण महाधमनी वाल्व एक प्रकार का रोग और अंततः की ओर जाता है, वेंट्रिकुलर बहिर्वाह बाधा2छोड़ दिया, केवल व्यवहार्य उपचार के रूप में शल्य वाल्व प्रतिस्थापन छोड़ ।
CAVD के pathophysiology जटिल है, लेकिन शारीरिक हड्डी खनिज के समान तंत्र शेयर3। Whilst, अध्ययन के एक नंबर osteogenic ट्रांस भेदभाव और कड़ा4,5से गुजरना VICs की क्षमता का प्रदर्शन किया है, इस प्रक्रिया underpinning तंत्र अभी तक पूरी तरह से आविर्भाव हो, पर प्रकाश डाला CAVD के एक व्यवहार्य और प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकता ।
प्रयोगशालाओं के एक नंबर से पिछले काम सफलतापूर्वक सुअर और गोजातीय मॉडल से VICs अलग है, और calcifying शर्तों के तहत इन कोशिकाओं को प्रसंस्कृत6,7,8। इन मॉडलों में महाधमनी वाल्व के बड़े आकार के कारण, एंजाइमी पाचन के माध्यम से कोशिकाओं का अलगाव अत्यधिक कोशिकाओं की शुद्ध आबादी पैदा करने में प्रभावी किया गया है । तथापि, इन मॉडलों को बड़े पशु प्रजातियों के लिए आणविक उपकरणों की सीमित उपलब्धता के कारण प्रतिबंधात्मक किया जा सकता है । इसके विपरीत, मूषक मॉडल अपेक्षाकृत कम लागत, आनुवंशिक हेरफेर के लिए संभावित, और आणविक उपकरण है कि आसानी से उपलब्ध है की व्यापक सरणी के कारण लाभप्रद रहते हैं । हालांकि, छोटे पशु मॉडलों से VICs के अलगाव व्यापक रूप से कार्यरत है, जो कठिनाइयों का सामना करना पड़ा जब छोटे ऊतक नमूनों के साथ काम करने की संभावना परिणाम है नहीं है ।
इस विस्तृत प्रोटोकॉल चूहे VICs के प्रत्यक्ष अलगाव के लिए एक व्यापक विधि की रिपोर्ट । वाल्व के सावधान विच्छेदन, द्वारा एंजाइमी डाइजेस्ट की एक श्रृंखला के बाद, VICs अलग किया जा सकता है और प्रयोगात्मक तकनीक की एक विस्तृत विविधता में कार्यरत, सेल संस्कृति, कड़ा सहित, और जीन अभिव्यक्ति । इस इन विट्रो CAVD के मॉडल निस्संदेह इस रोग की प्रक्रिया के बारे में हमारी जानकारी को बढ़ाने के लिए एक आवश्यक योगदान कर देगा ।
इस विस्तृत प्रोटोकॉल प्राथमिक चूहे VICs के अधिग्रहण के लिए एक व्यावहारिक विधि का वर्णन, एंजाइमी पाचन के माध्यम से चूहे दिल वाल्व से इन कोशिकाओं के अलगाव को सक्षम करने से । हमारी विधि आगे का समर्थन करता है और इन विट्रो मॉडल महाधमनी वाल्व13कड़ा अध्ययन करने के लिए एक पहले रिपोर्ट चूहे के उपयोग का विस्तार । महाधमनी वाल्व से VICs के अलगाव पड़ोसी VECs से संदूषण के लिए संभावित परिचय । हालांकि, हमारे इम्यूनोफ्लोरेसेंस डेटा की पुष्टि करें कि प्रारंभिक पाचन चरण VECs को निकालने के लिए पर्याप्त है, endothelial सेल मार्कर, CD31 के लिए पृथक कोशिकाओं नकारात्मक प्रतिपादन । इसके अलावा, α-SMA धुंधला VICs के सक्रिय phenotype, जो कड़ा12के लिए आवश्यक है की पुष्टि करता है ।
विक अलगाव पहले बड़े पशु मॉडल6,7,8में सूचित किया गया है । हालांकि, इन प्रजातियों के बहाव के अध्ययन के लिए उपलब्ध सीमित आनुवंशिक और आणविक उपकरणों के साथ ही दुनिया भर में प्रयोगशालाओं में उनके सीमित पहुंच से विवश हैं । इसके विपरीत, इस तरह के उपकरणों को अच्छी तरह से आसानी से उपलब्ध कुतर में स्थापित कर रहे है और इसलिए, चूहे व्युत्पंन VICs को अलग करने की क्षमता एक अधिक से अधिक प्रयोगात्मक डिजाइन क्षमता सक्षम बनाता है । युवा चूहों से VICs का उपयोग भी मतलब है कि कोशिकाओं को अपेक्षाकृत अधिक पुराने चूहों से अधिक प्रफलन हैं, इसलिए अधिक कोशिकाओं को उपज के लिए कम जानवरों की आवश्यकता होती है. हालांकि चूहे आसानी से सुलभ हैं, लेकिन चूहों के कारण विशेष रूप से छोटे दिल वाले, प्राथमिक माउस VICs के अलगाव अधिक समय लेने वाली और काफी अधिक पशुओं के लिए चूहे मॉडल के रूप में कोशिकाओं की एक ही उपज को अलग करने की आवश्यकता होगी ।
यह वर्णित दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि VICs अस्थाई जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक चूहों, साथ ही हृदय रोग और वाल्व चोट के चूहे मॉडल से अलग किया जा सकता है । चूहा मॉडल का उपयोग बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, इसलिए पशु उपयोग को कम करने के लिए, प्राथमिक चूहा VICs एक सेल लाइन का उत्पादन एक बार यह अच्छी तरह से किया गया है बदल सकता है ।
Whilst CAVD के गंभीर नैदानिक निहितार्थ व्यापक रूप से मांयता प्राप्त कर रहे हैं, अंतर्निहित करणीय तंत्र अभी तक निर्धारित किया जाना है । इसके अलावा, प्रभावी दवा उपचार है कि रोक सकता है और संभावित महाधमनी वाल्व कड़ा इलाज वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं । calcifying शर्तों के तहत VICs की संस्कृति इसलिए CAVD के इन विट्रो मॉडल में एक उच्च प्रासंगिक प्रदान करता है । हम बताते है कि ऊंचा Ca और Pi का स्तर प्रेरित osteogenic जीन मार्करों Msx2, Alpl, और Phospho1की अभिव्यक्ति में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ अलग चूहे VICs के इन विट्रो कड़ा में । यह व्यापक रूप से स्थापित है कि इन मार्करों संवहनी कड़ा14,15,16के रोग की प्रक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं । हमारे डेटा इसलिए पता चलता है कि calcifying माध्यम में चूहे VICs की संस्कृति एक उपयुक्त मॉडल है जिसके साथ महाधमनी वाल्व कड़ा इन विट्रो मेंअध्ययन करने के लिए है । वास्तव में, हमारी प्रयोगशाला से हाल के अध्ययनों से इस मॉडल का उपयोग किया है प्रदर्शित करने के लिए कि सीए विक के Annexin छठी संवर्धन के माध्यम से महाधमनी वाल्व कड़ा को बढ़ावा-व्युत्पंन मैट्रिक्स17।
चूहे VICs और उनके कुशल लक्षण वर्णन का उपयोग कर के लाभों के बावजूद, कुछ सीमाएं अभी भी मौजूद हैं । सबसे पहले, चूहे वाल्व के भीतर विक जनसंख्या का आकार बहुत छोटा है, और इसलिए कई जानवरों के क्रम में व्यापक के लिए पर्याप्त कोशिका संख्या उत्पंन करने के लिए आवश्यक है इन विट्रो अध्ययन । हालांकि, यह संभव है कि अमर वाल्व मध्यवर्ती कक्ष लाइनों में प्रारंभिक अध्ययन उपक्रम द्वारा इस सीमा को दूर, के रूप में हाल ही में हमारे द्वारा रिपोर्ट18, और बाद में प्राथमिक संस्कृतियों को रोजगार के लिए सत्यापित करें और इन निष्कर्षों का विस्तार ।
संक्षेप में, वर्णित विधि सफल अलगाव, संस्कृति, और प्राथमिक चूहे VICs, जो बाद में जैव रासायनिक परख सहित विश्लेषण की एक किस्म का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन और आरएनए विश्लेषण का मूल्यांकन किया जा सकता है की कड़ा बताते हैं । यह मॉडल एक विश्वसनीय और सुविधाजनक प्रणाली है जिसमें इन विट्रो मेंCAVD की जांच करने के लिए प्रदान करता है, और इस विनाशकारी रोग के लिए जिंमेदार आणविक तंत्र की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
CD31 एंटीबॉडी इस्तेमाल किया डॉ करेन टैन, एडिनबर्ग विश्वविद्यालय से एक उदार उपहार था । इस अध्ययन के एक संस्थान रणनीतिक कार्यक्रम अनुदान के रूप में जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC) से धन द्वारा समर्थित किया गया था (BB/J004316/ किउ/E/D/20221657) (VEM और CF), एक संस्थान कैरियर पथ फैलोशिप bb/F023928/1 (VEM), और एक BBSRC मामले में छात्र बी सी के माध्यम से छात्र धन/K011618/1 (नियंत्रण रेखा) ।
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
Spring curved (14 cm) | World Precision Instruments | 14112 | Autoclave before use. |
Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
SuperFine Vannas scissors (3 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 501778 | Autoclave before use. |
Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
Triton X100 | Sigma | X100 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera set up for Alizarin red images: | |||
Camera | Nikon D800 | ||
Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED |