Denne protokol beskriver isolation, kultur og forkalkning af rotte-afledte ventil interstitielle celler, en yderst fysiologiske i vitro model af forkalkede aortaklappen sygdom (CAVD). Udnyttelse af denne rotte model letter CAVD forskning i udforskning af celle og molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne komplekse patologiske proces.
Forkalkede aortaklappen sygdom (CAVD) er karakteriseret ved den gradvise fortykkelse af aorta ventilen foldere. Det er en tilstand, der ofte findes i ældre og slutstadiet nyresygdom (ESRD) patienter, der ofte lider af hyperphosphatemia og hypercalcæmi. I øjeblikket er der ingen medicin behandlingsformer, der kan stoppe sin progression. De mekanismer, der ligger til grund for denne patologiske proces forbliver uklart. Aortaklappen indlægsseddel er sammensat af et tyndt lag af ventil endotelceller (VECs) på den ydre overflade af aorta cusps med ventil interstitielle celler (VIC’erne) klemt inde mellem VECs. Brug af en rotte model gør det muligt for in vitro- undersøgelse af ektopisk kalcifikation baseret på i vivo physiopathological serum fosfat (Pi) og calcium (Ca) niveauer af patienter, der lider af hyperphosphatemia og hypercalcæmi. Den beskrevne protokol detaljer isolation af en ren rotte VIC befolkning som vist ved ekspression af VIC markører: alpha-glat muskel aktin (α-SMA) vimentin og væv vækst faktor beta (TGFβ) 1 og 2, og fraværet af klynge af differentiering (CD) 31, en VEC markør. Ved at udvide disse VIC’erne, kan biokemiske, genetiske og billeddiagnostiske undersøgelser udføres for at studere og optrævle de vigtigste mæglere bag CAVD.
Sund aortaklappen består af tre foldere, som fordelingen af mekanisk stress under åbning og lukning af ventilen fordeles ligeligt. Ventilen indlægsseddel har en defineret struktur af tre adskilte lag: fibrosa, spongiosa og ventricularis, hvilket hus ventil interstitielle celler (VIC’erne) som den dominerende celletype. Disse tre lag er klemt inde mellem to senge af ventil endotelceller (VECs)1.
VIC’erne spiller en afgørende rolle i udviklingen af forkalkede aorta ventil forkalkning (CAVD), den mest almindelige hjertesygdomme ventil i den vestlige verden. CAVD er beskrevet som en progressiv tilstand, der er aktivt reguleret af de utætte hjerteklapper væv og dens omgivende mikromiljø. Cellulære ændringer forårsage oprindeligt fibrotisk fortykkelse, og til sidst en omfattende forkalkning af aortaklappen foldere. Dette så fører til signifikant aorta ventil stenose og i sidste ende, venstre ventrikel udstrømning obstruktion2, forlader kirurgisk ventil udskiftning som den eneste levedygtige behandling.
CAVD Patofysiologi er kompleks, men deler lignende mekanismer til fysiologiske knogle mineralisering3. Mens en række undersøgelser har påvist VIC’erne evne til at gennemgå osteogenic trans-differentiering og forkalkning4,5, mekanismerne bag denne proces har endnu at blive fuldt belyst, fremhæve den afgørende forudsætning for en realistisk og relevant i vitro model af CAVD.
Tidligere arbejde af en række laboratorier har succesfuldt isolerede VIC’erne fra svin og kvæg modeller og kulturperler disse celler under kalcificerende forhold6,7,8. På grund af den store størrelse af aortaklappen i disse modeller, har isolation af celler gennem enzymatisk fordøjelsen været meget effektiv til at generere ren populationer af celler. Disse modeller kan dog restriktive på grund af de begrænsede mængder af molekylære værktøjer til store dyrearter. Derimod forbliver gnavere modeller fordelagtig på grund af relativt lavere omkostninger, potentiale for genmanipulation og den omfattende vifte af molekylære værktøjer, der er let tilgængelige. Men isolering af VIC’erne fra små dyremodeller er ikke bredt ansat, som er en sandsynlig konsekvens af de vanskeligheder, når du arbejder med små vævsprøver.
Denne detaljerede protokollen rapporterer en omfattende metode til direkte isolering af rotte VIC’erne. Ved omhyggelig dissektion af ventilen, fulgt af en serie af enzymatiske digestions, kan VIC’erne isoleret og ansat i en lang række eksperimentelle teknikker, herunder celle kultur, forkalkning og gen udtryk. Denne yderst relevant i vitro model af CAVD vil uden tvivl gøre et væsentligt bidrag til at øge vores viden om denne patologiske proces.
Denne detaljerede protokol beskriver en praktisk metode til erhvervelse af primære rotte VIC’erne, aktivering af isolation af disse celler fra rotte hjerteklapper gennem enzymatisk nedbrydning. Vores metode yderligere understøtter og udvider anvendelsen af en tidligere rapporteret rotte i vitro model til at studere aortaklappen forkalkning13. Isolering af VIC’erne fra aortaklappen introducerer potentialet for forurening fra nærliggende VECs. Men vores immunofluorescens data bekræfter, at det oprindelige fordøjelse skridt er tilstrækkelige til at fjerne VECs, gengivelse de isolerede celler negative i endothelial celle markør, CD31. Desuden bekræfter α-SMA farvning den aktiverede Fænotypen af VIC’erne, hvilke er krævede nemlig forkalkning12.
VIC isolering er tidligere blevet rapporteret i store dyre modeller6,7,8. Men disse arter er begrænset af de begrænsede genetiske og molekylære værktøjer tilgængelige for downstream undersøgelse, samt deres begrænset tilgængelighed i laboratorier rundt om i verden. Derimod er sådanne værktøjer veletableret i let tilgængelige gnavere og derfor evnen til at isolere rotte-afledte VIC’erne muliggør en større eksperimentelle design kapacitet. Brug af VIC’erne fra unge rotter betyder også, at cellerne er relativt mere proliferativ end ældre rotter, som derfor kræver mindre dyr at give flere celler. Selv om mus er lettilgængelig, men på grund af mus har især mindre hjerter, isolation af primære mus VIC’erne ville være mere tidskrævende og betydeligt flere dyr ville være forpligtet til at isolere det samme udbytte af celler som rotte model.
En væsentlig fordel ved denne beskrevne fremgangsmåde er at VIC’erne kan isoleres tidsligt fra vildtype og transgene rotter samt rotte modeller af hjerte-kar-sygdom og ventil skade. Ved hjælp af rotte model ville kræve et større antal dyr for storstilet forsøg, således for at reducere brug af dyr, primære rotte VIC’erne kan blive omdannet til at producere en cellelinje, når det har været godt præget.
Mens de alvorlige kliniske konsekvenser af CAVD er almindelig anerkendt, har af underliggende udløsende mekanismer endnu skal fastlægges. Derudover effektiv medicin behandlingsformer, der kan forebygge og potentielt helbrede aortaklappen forkalkning ikke er tilgængelige på nuværende. VIC’erne kultur under kalcificerende forhold giver derfor en yderst relevant i vitro model af CAVD. Vi viser, at forhøjede Ca og Pi niveauer fremkalde i vitro forkalkning af isolerede rotte VIC’erne med en ledsagende stigning i udtryk af osteogenic gen markører Msx2, Alplog Phospho1. Det er bredt fastslået, at disse markører er forbundet med den patologiske proces af vaskulære forkalkning14,15,16. Vores data viser derfor, at kulturen i rotte VIC’erne i kalcificerende medium er en passende model til at studere aortaklappen forkalkning in vitro. Ja, de seneste undersøgelser fra vores laboratorium har udnyttet denne model til at påvise, at Ca fremmer aortaklappen forkalkning gennem Annexin VI berigelse af VIC-afledte matrix vesikler17.
Trods fordelene ved at bruge rotte VIC’erne og deres effektiv karakterisering, eksisterer nogle begrænsninger stadig. Først, VIC indbyggertal i rotte ventiler er meget små, og derfor mange dyr er nødvendige for at generere tilstrækkelig celle tal for omfattende in vitro- undersøgelser. Det er dog muligt at overvinde denne begrænsning af virksomhed forundersøgelser i udødeliggjort ventil interstitiel cellelinjer, som for nylig rapporteret af os18, og efterfølgende ansættelse primære kulturer til at kontrollere og udvide disse resultater.
I Resumé forklarer metoden beskrevet vellykket isolering, kultur og forkalkning af primære rotte VIC’erne, som efterfølgende kan vurderes ved hjælp af en række analyser herunder biokemiske assays, såvel som proteiner og RNA analyser. Denne model tilbyder en pålidelig og praktisk system til at undersøge CAVD i in vitro, og giver et værdifuldt redskab for at undersøge de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for denne ødelæggende sygdom.
The authors have nothing to disclose.
CD31 antistof anvendes var en generøs gave fra Dr. Karen Tan, University of Edinburgh. Denne undersøgelse blev støttet af midler fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) i form af et institut strategiske program tilskud (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM og CF), et institut karriere sti Fellowship BB/F023928/1 (VEM), og studentship finansiering via en BBSRC sag Studentship BB/K011618/1 (LC).
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
Spring curved (14 cm) | World Precision Instruments | 14112 | Autoclave before use. |
Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
SuperFine Vannas scissors (3 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 501778 | Autoclave before use. |
Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
Triton X100 | Sigma | X100 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera set up for Alizarin red images: | |||
Camera | Nikon D800 | ||
Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED |