Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas
Summary
Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.
Abstract
Este protocolo describe el uso de la microscopia televisión en vitro para evaluar la función vascular en arterias aislada resistencia cerebral (y otros) y describe las técnicas para evaluar la perfusión del tejido usando Laser Doppler flujometría (LDF ) y densidad de microvasos utilizando fluorescencia etiquetada lectina Griffonia simplicifolia (GS1). Los métodos actuales para el estudio aislaron de las arterias de resistencia transmural presiones encontradas en vivo y en ausencia de células parenquimales influencias proporcionan un vínculo decisivo entre estudios en vivo e información obtenida de molecular enfoques reduccionistas que proporcionan la penetración limitada en respuestas integradoras a nivel de todo animal. LDF y técnicas para identificar selectivamente arteriolas y capilares con lectinas de GS1 marcada con fluorescencia ofrecen soluciones prácticas para permitir a los investigadores a ampliar el conocimiento obtenido de los estudios de las arterias de resistencia aislada. Este papel describe el uso de estas técnicas para obtener los conocimientos fundamentales de fisiología vascular y patología en la rata como modelo experimental general y en una variedad de especializado diseñado genéticamente cepas de ratas “diseñador” que pueden proporcionar penetración importante en la influencia de genes específicos en fenotipos vasculares importantes. Utilizando estas aproximaciones experimentales valiosos en cepas de ratas desarrolladas por cría selectiva estrategias y nuevas tecnologías para la producción de modelos de knockout del gen en la rata, se ampliará el rigor de los científicos locales desarrollado en modelos de ratón knockout y extender ese conocimiento a un modelo animal más relevante, con una formación fisiológica bien entendido y la idoneidad para estudios fisiológicos debido a su tamaño más grande.
Introduction
Los primeros estudios de la función vascular en las arterias del conducto arterias utilizadas y en muchos casos, la aorta. Generación de fuerza en las arterias grandes se estudió generalmente colocando un segmento de anillo de la arteria a un transductor de fuerza en un baño de tejido; en el caso de la aorta, por corte helicoidal tiras del barco para que las fibras de músculo liso fueron orientadas en una dirección longitudinal entre el punto de conexión y el transductor de fuerza, para proporcionar la mejor estimación de la fuerza generada por la contracción de el músculo liso a lo largo de su eje longitudinal. La técnica estándar para el corte de tiras helicoidales de aortas fue colocar una varilla de vidrio en el lumen del vaso, hacer un corte en la pared del vaso en el ángulo deseado y aferrarse al final del borde expuesto de la pared del vaso como el corte se extendió para producir toda una tira helicoidal del buque. En ese momento, el lado endotelial del vaso fue borrado general para eliminar la suciedad antes de colocar la tira del recipiente para el transductor de fuerza y sumergir la preparación en una oxigenada y temperatura controlada de baño tejido. Con el tiempo, que enfoque condujo a uno de los descubrimientos más famosos e importantes en la historia de la fisiología por Furchgott y fueron1, es decir, el papel del endotelio derivado factor relajante (EDRF), posteriormente identificado como óxido nítrico, en regulación de la función vascular. El evento crucial hacia ese descubrimiento fue una situación en la que los investigadores mantienen un endotelio intacto evitando el contacto del lado endotelial de la arteria con las superficies exteriores y notó que la franja aórtica no mostró el esperado contracción a acetilcolina (ACh), pero en su lugar relajado en respuesta a la ACh. Basado en esa observación, los investigadores desarrollaron una preparación de “sandwich” en el que une un segmento aórtico con un endotelio intacto (pero incapaz de generar la fuerza contráctil) a una franja helicoidal estándar de aorta y convirtieron la ACh inducida contracción en una relajación.
Dos importantes avances en esta área que son ampliamente utilizados hoy son el desarrollo de los preparativos para medir fuerza contráctil activo en pequeña resistencia arterias2,3 (como en el mesenterio intestinal3 ) y canulados resistencia arteria preparados4,5,6. En uno de los informes más tempranos, Mulvany y Halpern3 describe el uso de la preparación de miógrafo de alambre para el estudio de la fuerza contráctil activa en arterias de resistencia aislada desde el mesenterio intestinal de las ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y normotensos controles WKY. Tras el desarrollo del sistema wire miógrafo, canulado resistencia arteria preparaciones fueron desarrolladas para permitir estudios de los vasos en vivo condiciones4,5,6. Mientras que ambos métodos proporcionan resultados valiosos, la preparación de arteria canulado tiene las ventajas añadidas de más eficazmente preserva tono activo intrínseco en las arterias; y permitiendo a los investigadores estudiar activadas miógenas respuestas a los cambios en las respuestas de presión y vaso transmural a cambios en la tasa de flujo y esfuerzo cortante endotelial (ver revisión por Halpern y Kelley6).
Un objetivo principal del presente trabajo es describir cómo emplear la técnica ancestral de la microscopia video usando las arterias de resistencia aislada, canulado para obtener información precisa sobre los mecanismos que regulan el tono activo en estos cruciales vasos, independientes de influencias de la célula neuronal, humoral o parenquimatosa. Esta información básica, empleando un modelo de rata estándar y ejemplos de nuestros estudios de nuevo genéticamente diseñado cepas de ratas, proporcionará al lector una idea de los tipos de las ideas sobre la función vascular que puede ser adquirida con la televisión enfoques de la microscopia, y que pueden emplearse en estudios que incluyeron cualquier control y grupos experimentales el investigador elegir, incluyendo poderosos nuevos modelos experimentales rata producida por endogamia selectiva y recién desarrollado genética técnicas de ingeniería.
Gracias a la precisión de televisión métodos de microscopía, medición de los cambios de diámetro en preparaciones de arteria canulado puede proporcionar información muy valiosa sobre mecanismos endotelio-dependientes y endotelio-independiente de vascular relajación, así como alteraciones importantes (y a veces inesperadas) en los mecanismos de control vascular que ocurre con la hipertensión, dieta alta en sal y otras intervenciones experimentales. Además, medición de las relaciones de presión diámetro en aislado y canulados arterias de resistencia que máximo se relajan por el tratamiento con Ca2 +-libre solución o un fármaco vasodilatador farmacológico, permite al investigador evaluar cambios estructurales en las arterias debido a la remodelación vascular y para el cálculo de las relaciones de tensión pasiva7 que puede proporcionar la penetración importante en los cambios en las propiedades mecánicas pasivas de las arterias que pueden afectar la función arterial independiente de (o además de) los cambios en los mecanismos de control activo. También es importante tener en cuenta que información obtenida de los estudios de las arterias de resistencia aislada puede completarse con información obtenida utilizando LDF, un método práctico para evaluar la perfusión del tejido en el nivel animal entero8,9 ,10, y por información obtenida de la evaluación de la densidad de microvasos utilizando fluorescencia con lectinas de GS1, que específicamente se une a moléculas de la glicoproteína en la membrana basal de las arteriolas y los capilares pequeños11 , 12. el último método proporciona una estimación muy precisa de la densidad de microvasos que no está sujeto a las clásicas dificultades en estimar la densidad de microvessel contando barcos en vivo, por ejemplo falta sin perfusión recipientes donde el flujo sanguíneo se detiene debido al cierre activo de las arteriolas. Cuando se utilizan juntos, estos enfoques pueden proporcionar la penetración importante para correlacionar alteraciones funcionales en las arterias de resistencia aislada a los cambios en la perfusión del tejido a nivel microcirculatorio; y algunos ejemplos del uso de los enfoques valiosos en conjunción con técnicas de cannulated arteria también serán proporcionados en el presente manuscrito.
El presente trabajo se centra en el uso de técnicas de microscopia video para evaluar cambios vasculares en las arterias de ratas Sprague-Dawley exogámica. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estas técnicas han demostrado para ser muy valiosa en la aclaración de alteraciones fenotípicas en cepas de rata genéticamente altamente especializado creadas por cría selectiva o gen mediante técnicas de edición. En este manuscrito, nos proporcionan ejemplos de técnicas de microscopía de vídeo han proporcionado información importante sobre la función vascular en un número de rata valiosos modelos, incluyendo la cepa Dahl sensible a la sal (SS) rata, una rata endogámicas que es el más ampliamente utiliza el modelo experimental para estudiar los mecanismos de sal sensibles hypertenson18,19,20,21,22,23; y ratas de consomic creadas a través de cría selectiva de las ratas de la SS con la sal-insensible cepa de rata marrón Noruega (BN). En los paneles de la rata de consomic, cada cromosoma de la rata marrón ha sido río individualmente en el fondo genético Dahl SS24,25,26 . Uso de paneles de rata consomic ha proporcionado pistas valiosas en cuanto a cromosomas específicos que contribuyen a la sal sensibilidad de la presión arterial y otros fenotipos, como la reactividad vascular24,25,26 ,27,28.
Estrategias de crianza selectiva utilizando SS ratas y ratas de consomic llevar cromosomas BN individuales también han permitido la generación de tensiones congenic estrechas con pequeños segmentos de cada río de cromosomas marrón Noruega en la SS de Dahl genética Fondo22,29. Estos proporcionar valiosísimo entrada en genes específicos o reducir las regiones de los cromosomas que pueden afectar las variables fisiológicas cruciales, como la presión arterial, daño renal y reactividad vascular22,29. Otra potente adición a la caja de herramientas genética de rata es el desarrollo de modelos de ratón gene knockout utilizando avanzado gene incluyendo ZFNs, nucleasas activador-como-efector transcripcionales (TALENS), técnicas de edición y más recientemente CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. El advenimiento de estas poderosas técnicas que permiten a los genes a ser noqueado en la rata es un desarrollo sumamente importante porque gene knockout estudios hasta la fecha han utilizado (y seguirán usando) ratones casi exclusivamente. Otro componente experimental en el presente artículo demuestra el valor de arteria canulado técnicas y video microscopia para evaluar los mecanismos de control fisiológico en ratas knockout que carecen la transcripción protección antioxidante y la célula principal factor, factor nuclear (derivados del eritroide 2) – como – 2 (NRF2)30,31, que fueron desarrollados utilizando tecnología TALEN en ratas Sprague-Dawley genética17. En aquellos experimentos en vitro microscopia video se utilizaron técnicas para proporcionar verificación funcional de la pérdida del gen NRF2 y poner a prueba un enfoque terapéutico potencialmente valioso basado en directo upregulation de antioxidantes NRF2-mediada defensas. NRF-2 es de sustancial importancia terapéutica en la lucha contra el estrés oxidativo vascular en seres humanos, a la luz de los decepcionantes resultados de ensayos clínicos con administración directa de antioxidantes como las vitaminas C y E32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se señaló en la introducción, este trabajo describe el uso de la microscopia de la televisión y aislada resistencia arteria enfoques para evaluar la función vascular no sólo en modelos de ratón estándar (como en el video), pero también en altamente especializados genéticamente cepas de ingeniería rata, que muestra la novela y poderosas ideas que pueden ser adquiridas utilizando estos enfoques. El uso de estas poderosas técnicas para evaluar el tono activo y pasivos propiedades mecánicas de las arterias …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores expresan su sincero agradecimiento a Katie Fink y Lynn Dondlinger por su inestimable asistencia en la preparación de este manuscrito.
Apoyo de la beca: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; y #R01-HL128242.
Materials
| SS Rat | Medical College of Wisconsin | SS/JHsd/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.5BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 5BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.13BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 13BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-BN Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSA Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSB Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates | Medical College of Wisconsin | SD-Nfe212em1Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113755 | |
| High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113756 | |
| Colorado Video Caliper | Colorado Video, Inc. | Model 308 | |
| Video Camera | Hitachi | KPM1AN | |
| Microscope | Olympus Life Science | CKX41 | |
| Television Monitor | Panasonic | WVBM1410 | |
| Pressure Transducers | Stoelting | 56360 | |
| Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
| Cannulated Artery Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | Single vessel chamber for general use |
| Temperature Controller for Single Chamber | Living Systems Instrumentation | TC-09S | |
| Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight | Living Systems Instrumentation | GD-MS | Provides aeration in the vessel bath |
| Gas Exchange Oxygenator, Miniature | Living Systems Instrumentation | OX | Allows gas exchange with perfusate |
| Laser-Doppler Flowmeter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| GS1 Lectin | Vector Labs | RL-1102 | |
| Glass Capillary Tubes for Micropipettes | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm ID |
| Verticle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Nylon suture material (10/0)-3 PLY | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Protandim | Protandim | NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-3 | |
| Dextrose (d-glucose) anhydrous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
| Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
| Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | ED255-500G |
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