ويحدد هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتحليل إشارات الكالسيوم في النباتات التي تم إنشاؤها عن طريق تغذية الحشرات هيميبتيران، مثل المن. التمويل نبات تحول مع بيوسينسور الكالسيوم بروتينات فلورية خضراء GCaMP3 تسمح بالتصوير في الوقت الحقيقي في فيفو الديناميات الكالسيوم مع ارتفاع قرار الزماني والمكاني.
أيونات الكالسيوم يتوقع أن تكون كيانات إرسال الإشارات الرئيسية خلال التفاعلات الحيوية، مع إشارات الكالسيوم تشكل جزءا ثابتاً من رد الدفاع مصنع اليسيتورس الجرثومية وجرح الناجمة عن مضغ الحشرات، استخلاص الكالسيوم الجهازية إشارات في النباتات. دور الكالسيوم في فيفو أثناء الإجهاد الحيوية غير لا تزال غير واضحة. ويصف هذا البروتوكول استخدام جهاز استشعار الكالسيوم المرمزة وراثيا كشف الإشارات الكالسيوم في النباتات أثناء التغذية بالآفات هيميبتيران. بيرس هيميبتيرانس مثل المن عدد صغير من الخلايا مع متخصصة، ممدود مص فمها، يجعلها أداة مثالية لدراسة ديناميات الكالسيوم عندما يواجه مصنع لإجهاد حيوية، الذي يختلف عن استجابة إصابة. وبالإضافة إلى ذلك، هي ثورة الفلورسنت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية بقياس إشارات الجزيئات في فيفو في الحيوانات والنباتات. التعبير عن بيوسينسور كالسيوم القائم على التجارة والنقل، GCaMP3، في المصنع النموذجي نبات التمويل يسمح للتصوير في الوقت الحقيقي لديناميات الكالسيوم النباتية خلال الحشرة التغذية، مع ارتفاع قرار المكانية والزمانية. وقد وضعت مقايسة قابل للتكرار وقوية استخدام مجهر الأسفار أوراق GCaMP3 منفصلة، مما يسمح لقياس ديناميات الكالسيوم سيتوسوليك مستمرة قبل وأثناء وبعد تغذية الحشرة. وهذا يكشف ارتفاع كالسيوم سريع المترجمة بشدة حول المن تغذية الموقع الذي يحدث في غضون دقائق قليلة. البروتوكول يمكن تكييفها لتؤكد الحيوية الأخرى، مثل أنواع الحشرات إضافية، في حين يتيح استخدام التمويل أعطيت لتوليد طفرات سريعة لتسهيل التحليل الجزيئي لهذه الظاهرة.
الكالسيوم (Ca2 +) أحد العناصر إرسال الإشارات في كل مكان آخر في النباتات. ارتفاع عابر في سيتوسوليك Ca2 + تركيز ([Ca2 +]سيت) هو فك الشفرة بشبكة معقدة من المكونات المتلقين للمعلومات، وهو يشارك في التصدي لكل الضغوط اللاأحيائية والأحيائية1،2. ارتفاع [Ca2 +]سيت أحد الاستجابات الأولى للميكروبات اليسيتورس، تشكل جزء مشترك من مصنع الدفاع استجابة3،،من45. كما لوحظت زيادات في [Ca2 +[سيت ردا على إصابة الناجمة عن مضغ الحشرات، مثل lepidopterans،من67. بيد أن الدور المحتمل للنبات Ca2 + إشارات في الاستجابة للعيش التهديدات الحيوية التي تسبب الضرر للخلايا قليلة فقط لم تستكشف. المن Myzus persicae الخوخ الأخضر هو الحشرات هيميبتيران الذي يمثل تهديدا كبيرا للعالم الزراعة8،9، ويترك Ca2 + افلوكس من الفضاء خارج الخلية وقد لوحظ تعج بيرسيك م.10. هذه الخطوط العريضة للبروتوكول وسيلة قوية وقابلة للتكرار لقياس مصنع Ca2 + إشارات بينما بيرسيك م آر من أوراق استخدام فلورية Ca2 + بيوسينسور، مع المن و GCaMP3 تقديم أدوات الرواية التي تشريح دور Ca2 + خلال التفاعلات الحيوية.
Ca2 +-ميكروليكتروديس انتقائية واستخدمت سابقا لقياس [Ca2 +] في النباتات11،12. في الآونة الأخيرة، قد أصبح توحيد النهج طرحه ونيون. أجهزة الاستشعار هذه ربط Ca2 + وينبعث الضوء، مما يسمح للفرص غير موازية لدراسة Ca2 + الديناميات في الخلايا والأنسجة كاملة. يمكن حقن الأصباغ Ca2 + أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو أنتجت ستابلي عند إدخال biosensor الترميز تسلسل إلى جينوم الكائن الحي عن طريق التحويل (أي، وراثيا ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية). هذا الأخير يقدم مزايا الرئيسية المعرب عنها في الأنسجة الحية بسهولة وقادرة على ترجمة سوبسيلولار13. وكان البروتين أيكوورين، معزولة عن فيكتوريا أيكووريا (قنديل البحر) أول وراثيا المرمزة Ca2 + بيوسينسور المنتشرة في محطات14. بروتين طرحه، لا يتطلب أيكوورين الإثارة بالضوء الخارجي، الذي يتجنب chromophore تبيض وأوتوفلوريسسينسي15. أيكوورين وقد استخدمت بنجاح لقياس [Ca2 +] الدفقات في الاستجابة للمحفزات المختلفة، بما في ذلك درجة الحرارة16, مسببات الأمراض17،،من1819، التأكيد الملح على20 ،21، و جرح7. ومع ذلك، فإنه هو المحرومة من كثافة إشارة منخفضة نسبيا، مما يجعل الكشف عن [Ca2 +] الدفقات في خلايا فردية ومن الأنسجة مع استشعار سوء التعبير الصعبة13.
واستكمل وضع Ca2 + أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي يمكن أن فلوريس أيكوورين بالسماح لتحليل مفصل سوبسيلولار ومستوى الأنسجة من Ca2 + ديناميات. واحد من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت الأكثر شيوعاً هي نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق)-على أساس كاميليونس. كاميليونس الحنق تتألف من اثنين من البروتينات، عادة الحراجية المعتمدة ويفب، التي يتم إحضارها إلى الاتصال الوثيق بالتغير كونفورماشونال الناجمة عن الربط من Ca2 + إلى مجال كالمودولين في منطقة رابط يفب الحراجية المعتمدة. يسمح هذا الاتصال نقل الطاقة من الحركة إلى يفب، والتغير الناتج في الأسفار من هذه فلوروفوريس يسمح بتقدير دقيق [Ca2 +] من خلال حساب نسبة إشارات الأسفار من اثنين فلوروفوريس22. كاميليونس الحنق تعلو على صبغات الفلورسنت أيكوورين وغير راتيوميتريك، كما أنها أقل تأثرا بمستوى التعبير البروتين23 وغالباً ما يكون عائد أكبر فلورسنت، مما يسمح للخلايا وسوبسيلولار من التصوير23. على سبيل المثال، كاميليونس بكى مؤخرا استخدمت لتحديد Ca2 + إشارات بعيدة في النباتات وحل هذه للهاتف الخلوي مستوى24،،من2526.
اختراق الأخيرة مع نيون القائم على التجارة والنقل Ca2 + أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تم تطوير أجهزة الاستشعار الحساسة للغاية واحدة-فلوروفوري (واحد-FP). واحد-FP أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تتكون من واحد دائري المبدّلة بروتينات فلورية خضراء مرتبطة إلى كالمودولين والببتيد M13، مع Ca2 + الملزم كالمودولين مما أدى إلى رد فعل الماء بوساطة بين كالمودولين والتجارة والنقل حتى فيما يتعلق بالتجارة والنقل بروتوناتي وزيادة العائد الفلورسنت27،،من2829. أجهزة الاستشعار واحد-تنظيم الأسرة تقدم العديد من المزايا كاميليونس الحنق، بما في ذلك أبسط تصميم تجريبي ويحتمل أن تكون أعلى دقة الزمانية التصوير30. على الرغم من أن أجهزة الاستشعار واحد-تنظيم الأسرة لا يمكن قياس المطلقة [Ca2 +] بساطة كأجهزة استشعار الحنق، متفوقة لإشارات تحليل ديناميات الزماني والمكاني من Ca2 + 5،23. جكامبس هي واحدة من أجهزة الاستشعار واحد-FP بيستيستابليشيد28 وخضعت لعدة تعديلات تحسين الغلة الفلورسنت والنطاق الديناميكي، Ca2 + تقارب، والإشارات إلى الضجيج نسبة31،32 , 33 , 34-“جكامبس” وقد استخدمت بنجاح في النظم الحيوانية، مثل الفواكه و الخلايا العصبية الحركية الزرد35 يطير الوصلات العصبية العضلية34. أدت الطفرات العشوائية من GCaMP3 فئات إضافية من أجهزة الاستشعار واحد-تنظيم الأسرة، بما في ذلك GCaMP6 أولتراسينسيتيفي36 و GECOs29. GECOs استخدمت مؤخرا في التمويل نبات (يشار إليها من الآن فصاعدا أعطيت) لقياس Ca2 + الدفقات في الاستجابة إلى ATP وكيتين flg22 اليسيتور البكتيرية. كما أظهرت هذه الدراسة أن بيوسينسور R-جيكو تفوقت YC3.6 Cameleon الحنق من حيث إشارة القصوى التغيير والإشارات إلى الضجيج نسبة5.
بسبب سهولة الاستخدام وعالية الغلة الفلورسنت، وعالية الدقة الزمنية التي يمكن أن يتحقق مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية جكامب، تم ترميز GCaMP3 وراثيا في نبات تحت المروج فيروس تبرقش القنبيط 35S. الأدوات الجينية المتاحة للبحوث أعطيت السماح للتحليل الجزيئي المفصل Ca2 + الإشارات التي تقاس GCaMP3. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصور بيوسينسور GCaMP3 تحت مجهر fluorescence بدلاً من نظام [كنفوكل] أكثر تكلفة. يسمح هذا البروتوكول للتصوير، أساسي عند إجراء التجارب مع الإجهادات الأحيائية يعيش كل الأنسجة. التجربة مصممة بحيث يتم طرح أوراق منفصلة من النباتات 35S::GCaMP3 في المياه، لمنع هروب الحشرات وتقييد التغذية إلى أنسجة محددة. ولذلك يسمح بالطريقة المبينة في هذه الورقة لتحليل أوراق Ca2 + ديناميات خلال التغذية قبل بيرسيك م.، أسفر عن توصيف النبات رواية مما يشير إلى الاستجابة. هذا الأسلوب يمكن تكييفها أيضا للعمل مع غيرها من الضغوط الحيوية، مثل أنواع إضافية من الحشرات ومسببات الأمراض الميكروبية، والأنسجة النباتية الأخرى، مثل الجذور.
الطريقة الموضحة في هذه الورقة يسمح للتحليل في الوقت الحقيقي للمصنع-Ca2 + إشارات أثناء إجهاد حيوية مثل تغذية الحشرات فإنه يوضح أن أحد الردود المحطة الأولى لمثل هذه التهديدات مترجمة [Ca2 +]سيت رفع حول موقع تغذية الحشرة. من خلال استخدام طفرات، سيسمح هذا الأسلوب لتوصيف الجزيئية والفيزيولوجية لهذه الإشارات، التي لم يكن ممكناً في السابق. خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو التأكد من أن أوراق منفصلة ليست مفرطة بالانزعاج أثناء عملية مفرزة (الخطوة 3، 2) أو عند نقل الحشرات ليترك (الخطوة 4، 5). نظراً لأن البروتوكول الحالي يوفر قياس [Ca2 +]سيت بدلاً من تركيز مطلق نسبي، من المهم الاحتفاظ بالإعدادات مجهر ثابت في كافة مراحل التجربة. وهناك أيضا احتمال التحيز البشري أثناء اختيار رويس، وتحليل البيانات، وعلى هذا النحو، فإنه يوصي بإجراء التجارب مزدوجة التعمية.
وهناك العديد من المزايا الهامة لقياس [Ca2 +]سيت أثناء الإجهاد الحيوية مع هذا البروتوكول. أولاً، يتيح استخدام فلوروفوري واحد مع عالية غلة فلورسنت التصوير تجري في ستيريوميكروسكوبي، وأقل تكلفة من استخدام مجهر [كنفوكل]. استخدام فلوروفوري واحد أيضا يجعل من جمع وتحليل البيانات البسيطة، كما يوجد قياس واحد فقط لتسجيل. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام ستيريوميكروسكوبي لتصوير أوراق كاملة، وهو أمر ضروري نظراً لأن العديد من التفاعلات الحيوية، بما في ذلك التفاعلات بين النباتية-أولاً بأول وتحدث واسعة النطاق المكاني. عالية الدقة الزمنية للصورة التقاط ممكن مع GCaMP3، استناداً عدم اقتران السريع من Ca2 + من أجهزة الاستشعار بعد ربط23،30 وعالية الغلة الفلورسنت، ويسمح للمقاييس الواجب اتخاذها حتى كل 5 s. وعلاوة على ذلك، يمنع فحص أوراق هروب الحشرات، مفتاح الحد من خطوة لإجراء مثل هذه التجارب على النباتات كلها (قيد الإعداد). أوراق منفصلة أيضا ضمان أن الحشرة يتغذى من موقع محدد مسبقاً، مما يسمح لتحليل Ca2 + ديناميات قبل وأثناء وبعد الرضاعة. ويضمن هذا البروتوكول أيضا أن يترك لمراحل تنموية مشابهة تستخدم للتحليل.
والعيب الرئيسي لهذا البروتوكول تنبع من استخدام بيوسينسور غير راتيوميتريك. مع تنظيم الأسرة وحيدة أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، قد يؤدي الاختلاف في الانبعاثات بروتينات فلورية خضراء من المتغيرات التجريبية عدا [Ca2 +]سيت، مثل التغيرات في الرقم الهيدروجيني الخلوية أو الحركة أو مستوى التعبير بيوسينسور. هذه القضايا لا تصادف مع كاميليونس الحنق خلال الحنق، كما نقل الطاقة من الحركة إلى يفب تحدث فقط عند Ca2 + ملزمة. الشروط الأخرى التي تغير خصائص الفلورية fluorophores الفردية من غير المرجح لتقليد التغييرات المتعارضة في كثافة الحركة ويفب، وحساب راتيوميتريك المستخدمة أصلاً بضبط القياسات للعديد من هذه أخرى التحف الضوئية23،30. وهذا يجعل التقديرات المطلقة [Ca2 +]سيت أكثر موثوقية بالحنق كاميليونس. ونتيجة لذلك، GCaMP3 يستخدم أفضل بيوسينسور لقياس نسبي [Ca2 +]سيت، على الرغم من أنها ما زالت كافية لكشف وتوصيف الظواهر البيولوجية في النباتات5,(in preparation). ولذلك، من الضروري استخدام عناصر التحكم لإظهار أن التأثير الملاحظ سبب Ca2 +، بما في ذلك Ca2 +-المتصلة بطفرات وراثية(قيد الإعداد) أو Ca الدوائية2 + مثبطات قناة مثل La3 + . الأهم من ذلك، عرض واحد-FP أجهزة استشعار العوامل البيولوجية عادة الغلة الفلورسنت أكبر وأكبر مجموعة ديناميكية (أي زيادة في التنوير عند Ca2 + ملزمة) من الحنق كاميليونس23، مما يجعل جكامب أكثر ملاءمة مستوى الأنسجة التصوير، بينما بكى كاميليونس أداة مفيدة لتصوير الخلوية مع5،مجهر [كنفوكل]25.
أثناء تنفيذ هذا البروتوكول، فمن الممكن أن تنشأ بعض القضايا التي تحتاج إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها. على سبيل المثال، من المستحسن أن العينات التي تجاهلها يعرض ورقة التحكم (دون علاج) كبيرةسيت المرتفعات [Ca2 +] (خطوة 6.3). العابرين هذه هي على الأرجح نتيجة للإجهاد الناجم عن الفحص المجهري. في الواقع، هو معروف الضوء الأزرق إلى التماس Ca2 + إشارات38،39،،من4041، وقد يؤدي أيضا إلى ضوء الكثافة العالية في درجة الحرارة، وتؤكد ناضح كلاهما كما تحظى [Ca2 +]سيت المرتفعات21،25،42. ونتيجة لذلك، للحد من هذه الضغوط، من المهم إجراء التجربة في غرفة جيدة التهوية والتحكم في درجة الحرارة وتجنب مرات التعرض الطويل دون داع. من المهم أيضا عدم تعطيل الأوراق مفرطة مفرزة أو أثناء الفحص المجهري لمنع اللمس أثارت [Ca2 +]سيت المرتفعات43،،من4445. قد تصادف أيضا قضايا مع تسوية الحشرات. مع م. بيرسيك، لا تستقر الحشرات على الأوراق في عدة عينات. وهذا يمكن أن يكون نتيجة لآثار الجرح الدفاع في46،أوراق منفصلة47، أو الإخلال بالحشرات بالضوء الأزرق. في الواقع، تحكمها الرؤية في M. persicae photoreceptors الثلاثة، بما في ذلك واحدة مع حساسية ذروة من 490 نيوتن متر48. الحد من تعرض الفحص المجهري والتعامل مع المن مع الرعاية قد خفض الشدة والتشجيع على تسوية.
ويعطي البروتوكول الواردة في الورقة الحالية رؤى جديدة على فهم التفاعلات بين النبات-الحشرات الجزيئية واستجابة النبات للإجهاد الحيوية. أنها تسمح للتصور من أحد الردود المحطة الأولى لتغذية الحشرات وييسر مواصلة التحقيقات من خلال استخدام كبيرة أعطيت الموارد الوراثية المتاحة. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا البروتوكول باستخدام الكائنات الحية، كمقابل لاستخراج49 أو اليسيتورس50. في المستقبل، ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لتؤكد الحيوية الأخرى، مثل أنواع الحشرات إضافية، والديدان الخيطية أو مسببات الأمراض الميكروبية، وكذلك الإجهادات الأحيائية واللااحيائيه. يمكن أيضا تعديل مجهرية GCaMP3 الصورة في الأنسجة النباتية الأخرى، رويس البديلة على أوراق، أو النباتات كلها حتى. وعلاوة على ذلك، هناك احتمال بيوسينسور لتكون الوراثيةly المشفرة في الأنواع النباتية إضافية. ونتيجة لذلك، البروتوكول الواردة في هذه الورقة لديه القدرة على السرية الأساس الجزيئي ل Ca2 + إشارات في طائفة من رواية التفاعلات الحيوية بين النباتات وغيرها من الأنواع.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر منحة كالدر (مركز جون إينيس، المملكة المتحدة) للحصول على المشورة فيما يتعلق بالفحص المجهري. الكتاب تود أيضا أن أشكر جون إينيس مركز البستنة وأقسام علم الحشرات لمساعدتها. أيد هذا العمل منحة دكتوراه من جون إينيس مؤسسة (التلفزيون)، منحة ب/JJ004561/1 من بسرك ومؤسسة جون إينيس (التلفاز، ماجستير، J.C.، س. م.، وادمغة، الخرائط، و D.S.)، سنة في صناعة التنسيب من مركز جون إينيس (شهادة الماجستير) ، سنهم صيف من “جمعية الكيمياء الحيوية” “المملكة المتحدة” (كيركراده)، JST المعزوفة (فرص)، ومنح المجلس 1329723 ودائرة الرقابة الداخلية–1557899 من “المؤسسة الوطنية للعلوم” (فرص و S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |