פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לניתוח אותות סידן בצמחים שנוצר על ידי האכלה חרקים hemipteran, כגון כנימות. תודרנית לבנה טרנספורמציה עם החיישן סידן GFP GCaMP3 מאפשרים בזמן אמת אין ויוו ההדמיה של סידן דינמיקה עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה.
יוני הסידן צפויים להיות ישויות איתות מפתח במהלך אינטראקציות ביוטיים, עם סידן איתות ויוצרים חלק בלתי מבוססת התגובה ההגנה צמח elicitors מיקרוביאלי, ופצעו הנגרמת על ידי לעיסה חרקים, העלאת סידן מערכתית אותות בצמחים. עם זאת, תפקידו של הסידן ויוו במהלך ללחץ ביוטיים לא ברור עדיין. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישן סידן מקודד גנטית כדי לזהות אותות סידן בצמחים שהאכילה מאת נודניק hemipteran. Hemipterans כגון כנימות פירס מספר קטן של תאים עם מתמחה, מוארך יניקה mouthparts, שהופך אותם כלי אידיאלי ללמוד סידן dynamics בעת צמח מתמודד עם דגש ביוטיים, אשר היא נבדלת לתגובה wounding. בנוסף, פלורסנט ביולוגיים הם מהפכה המידה של איתות מולקולות ויוו של בעלי חיים וצמחים. ביטוי של סידן מבוסס-GFP ביוסנסור, GCaMP3, בצמח דגם תודרנית לבנה מאפשר ההדמיה בזמן אמת של הצמח סידן דינמיקה במהלך חרק האכלה, בעל רזולוציה גבוהה של יכולות. וזמינותו הדיר וחזק פותחה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות את העלים GCaMP3 מנותק, המאפשר מדידה רציפה של סידן cytosolic dynamics לפני, במהלך, ואחרי האכלה חרקים. זה חושף העלאת סידן מהירה מאוד מותאמת לשפות אחרות סביב מימדיה האכלה באתר המתרחשת בתוך דקות ספורות. הפרוטוקול ניתן להתאים מדגיש ביוטיים אחרים, כמו מינים חרקים נוספים, תוך שימוש תודרנית לבנה מאפשר לדור מהירה של מוטציות כדי להקל על הבדיקה המולקולרית של התופעה.
סידן (Ca2 +) היא אחד המרכיבים איתות הכי נפוץ בצמחים. עלייה Ca cytosolic2 + ריכוז ארעי ([Ca2 +]cyt) מפוענח על ידי רשת מורכבת של רכיבים במורד הזרם, ומעורב התגובה בשני מדגיש והאביוטיים וביוטי1,2. עלייה [Ca2 +]cyt היא אחת התגובות הראשונות elicitors מיקרוביאלי, ויוצרים חלק משותף של הצמח הגנה תגובה3,4,5. עליות [Ca2 +]cyt נצפו גם בתגובה ופצעו הנגרמת על ידי לעיסה חרקים כמו6,lepidopterans7. עם זאת, התפקיד הפוטנציאלי של צמח Ca2 + אותות בתגובה לחיות איומים ביוטיים לגרום נזק רק כמה תאים לא נחקרו. כנימות עלה אפרסק ירוק המידע שיפורט להלן מתייחס הוא חרק hemipteran המייצג איום משמעותי בעולם החקלאות8,9, ומשאיר Ca נצפתה2 + בזרימת מן המרחב חוץ-תאית שורץ שיפורט להלן מתייחס מ10. זה מתאר פרוטוקול שיטה חזקה הדיר למדידת צמח Ca2 + אותות בזמן מ שיפורט להלן מתייחס ניזונים מן העלים באמצעות של פלורסנט Ca2 + ביוסנסור, עם כנימות והן GCaMP3 המציע כלים חדשניים שאליו לנתח את התפקיד של Ca2 + במהלך אינטראקציות ביוטיים.
Ca2 +-סלקטיבית microelectrodes שימשו בעבר כדי למדוד [Ca2 +] צמחים11,12. לאחרונה, גישות זוהרים פלורסנט יש להפוך סטנדרטית. ביולוגיים אלה לאגד2 + Ca, פולטים אור, המאפשר הזדמנויות בלתי paralleled בחקר Ca2 + דינמיקה של תאים ורקמות שלם. Ca2 + ביולוגיים ניתן להזריק לפי צבע או stably מצחק המבוא של החיישן קידוד רצף לתוך הגנום של האורגניזם באמצעות טרנספורמציה (קרי, מקודדים גנטית ביולוגיים). האחרון מציע היתרונות הגדולים בלהיות בקלות מתבטאות רקמה חיה, מסוגל לוקליזציה subcellular13. חלבון aequorin, מבודד Aequorea ויקטוריה (מדוזה) היה הראשון מקודדים גנטית Ca2 + החיישן לפרוס צמחים14. כמו חלבון זוהרים, לא דורשת aequorin עירור על ידי אור חיצוני, אשר מונע כרומופור הלבנת ו- autofluorescence15. אאקורין שימש בהצלחה למדוד [Ca2 +] פלקסים בתגובה לגירויים שונים, כולל טמפרטורה16, פתוגנים17,18,19, מלח להדגיש20 ,21, ופצעו7. עם זאת, זה היא נחותה על ידי עוצמת אות נמוכה יחסית, ביצוע הזיהוי [Ca2 +] פלקסים בתאים בודדים ומן הרקמות עם חיישן המסכן ביטוי קשה13.
הפיתוח של Ca2 + ביולוגיים יכולים לזרוח השלים aequorin ומאפשר ניתוח subcellular, רקמות ברמת מפורט של Ca2 + דינמיקה. אחד ביולוגיים פלורסנט הנפוצים ביותר הם העברת האנרגיה תהודה קרינה פלואורסצנטית (סריג)-מבוסס Cameleons. סריג Cameleons מורכבים שני חלבונים, בדרך כלל CFP ו YFP, אשר מובאים במגע קרוב ידי השינוי הסתגלותי המושרה על-ידי האיגוד של Ca2 + לתחום קלמודולין באזור מקשר CFP-YFP. קשר זה מאפשר ההעברה של אנרגיה מן CFP YFP ולאחר השינוי שנוצר ידי קרינה פלואורסצנטית של אלה fluorophores מאפשר כימות מדויק של [Ca2 +] דרך חישוב היחס בין האותות פלורסצנטיות משני fluorophores22. סריג Cameleons נעלים על צבעי נמכרות aequorin, הלא-רציומטרי, כפי שהם שמושפעת פחות רמת ביטוי של חלבונים23 , לעיתים קרובות יש תשואה פלורסנט גדול יותר, ומאפשר הדמיה, הסלולר, subcellular23. כך למשל, סריג Cameleons לאחרונה שימשו לזיהוי הבינעירוניים Ca2 + אותות בצמחים וכדי לפתור את הסלולר רמה24,25,26.
פריצת הדרך האחרונה עם פלורסנט מבוסס-GFP Ca2 + ביולוגיים כבר התפתחות ביולוגיים רגישה מאוד חד-fluorophore (חד-FP). יחיד-FP ביולוגיים מורכבים של יחיד באופן מעגלי permutated GFP מקושר קלמודולין ו M13 פפטיד, עם Ca2 + מחייב את קלמודולין, וכתוצאה מכך לתגובה בתיווך מים בין קלמודולין GFP אז ולביטול protonate GFP עלייה התשואה פלורסנט27,28,29. יחיד-FP חיישנים מציעים כמה יתרונות על פני Cameleons סריג, כולל תכנון ניסויים פשוטים יותר רזולוציה טמפורלית פוטנציאל גבוה יותר של הדמיה30. למרות יחיד-FP חיישנים אי אפשר לכמת המוחלט [Ca2 +] הכי פשוט כמו סריג חיישנים, הם נעלה על הניתוח של הדינמיקות הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי של Ca2 + מסמן5,23. GCaMPs הן אחד יחיד-FP חיישנים best-established28 , עברו מספר תיקונים כדי לשפר שלהם תשואה פלורסנט טווח דינמי, Ca2 + אהדה, יחס אות לרעש31,32 , 33 , 34. GCaMPs בהצלחה השתמשו במערכות בעלי חיים, כגון דג זברה מוטורי לגלוקוז35 ופירות לטוס צמתי neuromuscular34. מוטגנזה מכוונת אקראי של GCaMP3 הביא שיעורים נוספים של חיישנים יחיד-FP, כולל GCaMP6 העדינה36 ו- GECOs29. GECOs שימשו לאחרונה תודרנית לבנה (המכונה מעתה ואילך תודרנית) כדי למדוד Ca2 + פלקסים בתגובה ATP, כיטין, את flg22 elicitor חיידקי. מחקר זה הראה גם כי החיישן R-GECO ביצועים טובים יותר את YC3.6 Cameleon סריג במונחים של האות המקסימלי השינוי ואת אות לרעש יחס5.
בגלל הקלות של שימוש, ההובג הקופתל פלורסנט ברזולוציה הטמפורלית גבוהה ניתן להשיג עם GCaMP ביולוגיים, GCaMP3 היה גנטית המקודדת תודרנית תחת כרובית מוזאיקת 35S האמרגן. הכלים גנטית למחקר תודרנית מאפשרים ניתוח מולקולרית מפורט של Ca2 + האותות נמדדת GCaMP3. בנוסף, ניתן לאבחן את החיישן GCaMP3 תחת מיקרוסקופ זריחה במקום מערכת קונאפוקלית costlier. פרוטוקול זה מאפשר כל רקמות הדמיה, חיוני בעת ביצוע ניסויים עם לחצים ביוטיים בשידור חי. הניסוי תוכנן כך העלים מנותקת מצמחים 35S::GCaMP3 הם צף במים, כדי למנוע בריחה חרקים וכדי להגביל האכלה לרקמות ספציפיות. שיטת המתוארים במאמר זה ולכן מאפשרת לניתוח של עלה Ca2 + דינמיקה שהאכילה מאת שיפורט להלן מתייחס מ, וכתוצאה מכך האפיון של צמח הרומן איתות התגובה. בשיטה זו ניתן גם להתאים לעבודה עם לחצים ביוטיים אחרים, כגון מיני חרקים נוספים חיידקים פתוגנים, ועם רקמות הצמח אחרות, כגון שורשים.
השיטה המתוארת במאמר זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של הצמח Ca2 + איתות במהלך מתן דגש ביוטיים כגון חרקים. הוא מדגים כי באחת התגובות הצמח הראשון איומים שכאלה הוא המותאמות לשפות אחרות [Ca2 +]cyt העלאת סביב האתר האכלה של החרק. באמצעות מוטציות, יאפשר בשיטה זו האפיון פיזיולוגיים המולקולריים של אותות כאלה, דבר שלא היה אפשרי בעבר. שלב קריטי ב פרוטוקול זה נועד להבטיח כי העלים מנותקת אינם מופרעים בצורה מוגזמת במהלך תהליך הניתוק (שלב 3.2) או בעת העברת חרקים העלים (שלב 4.5). בהתחשב בכך הפרוטוקול הנוכחי מספק מדידה יחסית [Ca2 +]cyt ולא של ריכוז מוחלט, זה חיוני כי ההגדרות מיקרוסקופ נשמרים קבועה לאורך כל הניסוי. יש גם פוטנציאל נטאי אנושי במהלך בחירת ROIs וניתוח של הנתונים, ככזה, מומלץ כי מתבצעות כפול סמיות.
ישנם מספר יתרונות משמעותיים של מדידה [Ca2 +]cyt במהלך ללחץ ביוטיים עם פרוטוקול זה. ראשית, השימוש fluorophore יחיד עם פלורסנט תשואה גבוהה מאפשרת ההדמיה להתנהל על stereomicroscope, אשר הוא פחות יקר מאשר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השימוש fluorophore יחיד מאפשר גם לאיסוף וניתוח הנתונים פשוטה, כפי שיש מדידה אחת רק כדי להקליט. בנוסף, השימוש stereomicroscope מאפשר ההדמיה של עלים כולו, שהוא חיוני לאור העובדה אינטראקציות ביוטיים רבים, כולל אינטראקציות צמח-כנימות עלה, להתרחש בקנה מידה גדול מרחבי. הרזולוציה הגבוהה הטמפורלי של התמונה ללכוד אפשרי עם GCaMP3, בהתבסס על השיוך מהירה של Ca2 + חיישן לאחר איגוד23,30 ו את התשואה נמכרות גבוהה, מאפשר למדידות להילקח עד כל 5 s. יתר על כן, וזמינותו עלה מונע הבריחה של החרק, מפתח הגבלת צעד כזה ניסויים על כל הצמחים (בהכנה). העלים מנותק גם להבטיח כי החרק ניזון ממיקום מוגדר מראש, המאפשר הניתוח של Ca2 + דינמיקה לפני, במהלך, ואחרי האכלה. פרוטוקול זה גם מבטיח כי עלים של שלבים התפתחותיים דומים משמשים לצורך ניתוח.
החיסרון העיקרי של פרוטוקול זה מקורו של השימוש ביוסנסור הלא-רציומטרי. עם יחיד-FP ביולוגיים, וריאציה של פליטה GFP העלולות לנבוע משתני הניסוי חוץ [Ca2 +]cyt, כגון שינויים השתגעת לגמרי, תנועה או את רמת הביטוי החיישן. נושאים אלה הם לא נתקלתי עם סריג Cameleons במהלך סריג, כמו ההעברה של אנרגיה מן CFP ל YFP מתרחשת רק בעת Ca2 + מחייב. מצבים אחרים לשנות את מאפייני fluorophores בודדים פלורסנט צפויים לחקות את השינויים מנוגדות בעוצמתם של CFP, YFP ולאחר בחישוב רציומטרי המשמש מטבעו מווסת את המידות עבור רבים מהם אחרים23,אופטי חפצים30. זה הופך את הערכות של מוחלטת [Ca2 +]cyt אמינה יותר עם סריג Cameleons. כתוצאה מכך, GCaMP3 הטוב ביותר משמש ביוסנסור למדוד יחסית [Ca2 +]cyt, למרות שזה עדיין מספיק כדי לזהות ולאפיין תופעות ביולוגיות5צמחים,(in preparation). לכן, זה חיוני כדי להשתמש בפקדים כדי להציג את האפקט הנצפה עקב Ca2 +, כולל Ca2 +-הקשורים מוטציות גנטיות(בהכנה) או תרופתי Ca2 + ערוץ מעכבי כגון La3 + . חשוב, יחיד-FP ביולוגיים בדרך כלל להציג תשואה פלורסנט גדול וחדר גדול טווח דינמי (קרי, עלייה florescence על Ca2 + איגוד) מאשר סריג Cameleons23, מה שהופך את GCaMP המתאים רקמות ברמת הדמיה, בעוד סריג Cameleons הם כלי שימושי עבור הדמיה הסלולר עם מיקרוסקופ קונפוקלי5,25.
במהלך הביצוע של פרוטוקול זה, זה אפשרי כי בעיות יקום הדורשות פתרון בעיות. לדוגמה, מומלץ כי דגימות שבו השליטה (מטופל) עלה מוצג גדול [Ca2 +]cyt הגבהים שנמחקו (שלב 6.3). תופעות מעבר כזה הן ככל הנראה התוצאה של הלחץ הנגרם על ידי מיקרוסקופ. ואכן, האור הכחול ידוע שמעודדים Ca2 + אותות38,–39,–40,–41, האור בעוצמה גבוהה עשויה גם לגרום טמפרטורה, מדגיש osmotic, אשר שניהם גם להפיק [Ca2 +]cyt הגבהים21,25,42. כתוצאה מכך, להפחתת לחצים כזה, חשוב לערוך את הניסוי בחדר מאוורר היטב, טמפרטורה מבוקרת וכדי למנוע פעמים חשיפה ארוכה שלא לצורך. חשוב גם לא לשבש את העלים בצורה מוגזמת במהלך ניתוק או במהלך של מיקרוסקופ כדי למנוע מגע-elicited [Ca2 +]cyt הגבהים43,44,45. ייתכן גם נתקל בעיות עם חרקים ליישוב. עם מ’ שיפורט להלן מתייחס, החרקים אל תתפשר על העלים מספר הדגימות. זה יכול להיות תוצאה של הפצע-elicited ההגנה46,את העלים מנותקת47, או ההפרעה של החרקים באור כחול. אכן, חזון שיפורט להלן מתייחס מ נשלטת על ידי שלוש photoreceptors, כולל אחת עם רגישות שיא של 490 nm48. הפחתת החשיפה מיקרוסקופ וטיפול הכנימות עם טיפול עשוי להפחית מצוקה ולעודד ליישוב.
פרוטוקול שמתואר הנייר הנוכחי נותן תובנות חדשות על ההבנה מולקולרית של אינטראקציות צמח-חרק ואת התגובה צמח ללחץ ביוטיים. זה מאפשר החזיית באחת התגובות הצמח הראשון להאכיל חרקים ו מקלה עוד יותר חקירות באמצעות שימוש ניכר תודרנית גנטי המשאבים הזמינים. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר השימוש של אורגניזמים חיים, בניגוד תמציות49 או elicitors50. בעתיד, טכניקה זו יכול להיות מיושם מדגיש ביוטיים אחרים, כגון מיני חרקים נוספים, נמטודות או חיידקים פתוגנים, וכן מדגיש והאביוטיים. כן, ניתן לשנות את מיקרוסקופ GCaMP3 לשיקוף רקמות הצמח אחרות, ROIs אלטרנטיבית על עלה או צמחים שלמים אפילו. יתר על כן, יש הפוטנציאל החיישן להיות תורשתיly המקודדת מיני צמחים נוספים. כתוצאה מכך, פרוטוקול המתוארים במאמר זה יש פוטנציאל סמוי הבסיס המולקולרי של Ca2 + איתות בטווח של הרומן ביוטיים אינטראקציות בין צמחים לבין מינים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות גרנט קלדר (ג’ון אינס מרכז, בריטניה) על העצה בנושא מיקרוסקופ. המחברים גם רוצים להודות את ג’ון אינס הגננות ומרכז המחלקות לאנטומולוגיה לסיוע שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי studentship PhD מן ג’ון אינס קרן (בטלויזיה), מענק B/JJ004561/1 של BBSRC ושל קרן ג’ון אינס (טלוויזיה, M.A., ג’יי, בארקדיה, תרגום, ט. מ, ד. ש.), שנה בהצבה התעשייה מ ג’ון אינס מרכז (M.A.) , studentship הקיץ מן האגודה הביוכימי של בריטניה (ג’יי), JST פרסטו (מ. ת), מענקים MCB 1329723 ו- IOS-1557899 של הקרן הלאומית למדע (מ. ת ו ש. ג).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |