Este protocolo describe un método sencillo para analizar las señales de calcio en las plantas generadas por hemipteran insectos, como pulgones. Thaliana de Arabidopsis transformada con el biosensor de calcio GFP GCaMP3 permiten la proyección de imagen en tiempo real en vivo de la dinámica de calcio con una alta resolución temporal y espacial.
Los iones del calcio se predicen para ser entidades de señalización claves durante las interacciones bióticas, con señalización de calcio formando una parte establecida de la respuesta de la defensa de la planta a elicitores microbianas y heridas causadas por la masticación de insectos, obtención de calcio sistémico señales en las plantas. Sin embargo, el papel del calcio en vivo durante el estrés biótico es todavía incierto. Este protocolo describe el uso de un sensor de calcio genéticamente codificados para detectar señales de calcio en las plantas durante la alimentación por una plaga hemipteran. Hemípteros como pulgones perforan un pequeño número de células con especializado, alargado aspira zonas bucales, lo que la herramienta ideal para estudiar la dinámica de calcio cuando una planta se enfrenta a un estrés biótico, que es distinto de una respuesta hiriente. Además, biosensores fluorescentes están revolucionando la medida de señalización moléculas en vivo en animales y plantas. Expresando un biosensor de calcio basada en GFP, GCaMP3, en la planta modelo Arabidopsis thaliana permite la proyección de imagen en tiempo real de la dinámica de calcio planta en insectos de alimentación, con una alta resolución espacial y temporal. Un análisis repetible y robusto ha sido desarrollado utilizando la microscopía de fluorescencia de hojas desprendidas de la GCaMP3, lo que permite la medición continua de la dinámica del calcio citosólico antes, durante y después de la alimentación de insectos. Esto revela una elevación de calcio rápido muy localizada alrededor de este sitio que ocurre dentro de unos minutos de alimentación. El protocolo puede ser adaptado a otros estreses bióticos, como otras especies de insectos, mientras que el uso de Arabidopsis thaliana permite la rápida generación de mutantes para facilitar el análisis molecular del fenómeno.
Calcio (Ca2 +) es uno de los elementos de señalización más ubicuos en las plantas. Un aumento transitorio en la concentración citosólica de Ca2 + ([Ca2 +]cyt) es descifrado por una compleja red de componentes aguas abajo y está implicado en la respuesta a ambos estreses bióticos y abióticos1,2. Un aumento de [Ca2 +]cyt es una de las primeras respuestas a elicitores microbianas, formando una parte común de la planta defensa respuesta3,4,5. Aumento de [Ca2 +]cyt también se han observado en respuesta a heridas causadas por la masticación de insectos como lepidópteros6,7. Sin embargo, el papel potencial de la planta de Ca2 + señales en respuesta a amenazas bióticas causantes de daños en sólo unas pocas células en vivo no ha sido explorado. El pulgón verde del durazno Myzus persicae es un hemipteran insecto que representa una amenaza significativa para el mundo agrícola8,9, y Ca2 + la emanación desde el espacio extracelular se ha observado en hojas infestados con M. persicae10. Este esquemas de protocolo un método robusto y repetible para medir la planta Ca2 + señales mientras que M. persicae se alimentan de las hojas utilizando un biosensor de Ca2 + fluorescente, con áfidos y GCaMP3 que ofrece novedosas herramientas con las que a diseccionar el papel de Ca2 + durante las interacciones bióticas.
CA2 +-microelectrodos selectivos se utilizaron antiguamente para medir [Ca2 +] en las plantas11,12. Más recientemente, enfoques bioluminiscentes y fluorescentes han ser estandarizados. Estos biosensores se unen Ca2 + y emiten luz, teniendo en cuenta oportunidades sin paralelo para el estudio de dinámica de Ca2 + en células y tejidos todo. Biosensores2 + CA pueden inyectarse como tintes o estable producidos por la introducción del biosensor codificación secuencia en el genoma del organismo a través de la transformación (es decir, genéticamente codificado biosensores). Este último ofrece las principales ventajas de ser fácilmente expresada en tejido vivo y capaz de localización subcelular13. La proteína aequorin, aislada de Aequorea victoria (Medusa) fue el primer genéticamente codificados Ca2 + biosensor en plantas14. Como una proteína bioluminiscente, aequorin no requieren excitación por luz externa, lo que evita la decoloración del cromóforo y autofluorescencia15. Aequorin se ha utilizado con éxito para medir flujos de [Ca2 +] en respuesta a varios estímulos, incluyendo temperatura16, patógenos17,18,19, sal estrés20 ,21e hirió a7. Sin embargo, es perjudicado por la intensidad de señal relativamente baja, haciendo la detección de flujos de [Ca2 +] en las células individuales y de tejidos con sensor pobre expresión difícil13.
El desarrollo de Ca2 + biosensores que pueden emitir fluorescencia ha complementado aequorin permitiéndole realizar detallado análisis subcelular y a nivel de tejido de Ca2 + dinámica. Uno de los biosensores fluorescentes más comunes son la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)-base Cameleons. TRASTE Cameleons están compuestos de dos proteínas, típicamente PPC y YFP, que se traen en contacto por el cambio conformacional inducido por la Unión del Ca2 + en un dominio de la calmodulina en la región de vinculador de CFP-YFP. Este contacto permite a la transferencia de energía de CFP YFP, y el cambio resultante en la fluorescencia de estos fluoróforos permite la cuantificación exacta de [Ca2 +] mediante el cálculo de la relación de las señales de fluorescencia de los dos fluoróforos22. TRASTE Cameleons son superiores a los tintes fluorescentes aequorin y no proporcionales, ya que son que menos afectados por el nivel de expresión de la proteína23 y a menudo tienen un mayor rendimiento fluorescente, que permite proyección de imagen celular y subcelular23. Por ejemplo, traste Cameleons han utilizado recientemente para identificar Ca2 + señales de larga distancia en las plantas y para resolver a nivel celular24el,25,26.
Un avance con fluorescente basada en GFP Ca2 + biosensores ha sido el desarrollo de biosensores altamente sensible solo-fluoróforo (single-FP). Biosensores de FP solo consisten en una sola circular permutated GFP se relaciona una calmodulina y péptido M13, con Ca2 + Unión a calmodulina, dando por resultado una reacción mediada por el agua entre calmodulina y GFP tan protonate GFP y aumento rendimiento fluorescente27,28,29. FP-solo sensores ofrecen varias ventajas sobre el traste Cameleons, incluyendo el diseño experimental más simple y una potencialmente mayor resolución temporal de30la proyección de imagen. Aunque solo FP sensores no pueden cuantificar absoluto [Ca2 +] como simplemente como sensores de trastes, que son superiores para el análisis de la dinámica temporal y espacial de Ca2 + señales5,23. GCaMPs son uno de los mejor de sensores solo FP28 y han sufrido varias revisiones para mejorar su rendimiento fluorescente, rango dinámico, Ca2 + afinidad y relación señal a ruido31,32 , 33 , 34. el GCaMPs han utilizado con éxito en sistemas animales, tales como frutas y peces cebra las neuronas de motor35 volar ensambladuras neuromuscular34. Mutagénesis al azar del GCaMP3 ha dado lugar a clases adicionales de sensores solo FP, incluyendo el ultrasensible GCaMP636 y los GECOs29. Los GECOs han utilizado recientemente en Arabidopsis thaliana (en adelante denominado Arabidopsis) para medir flujos de Ca2 + en respuesta a ATP, quitina y la flg22 bacteriana elicitor. Este estudio también demostró que el biosensor R-GECO superó el traste Cameleon YC3.6 en términos de máxima señal cambio y signal to noise ratio5.
Debido a la facilidad de uso, alto rendimiento fluorescente y alta resolución temporal que puede lograrse con biosensores de GCaMP, GCaMP3 fue codificada genéticamente en Arabidopsis bajo el promotor del virus del mosaico del coliflor 35S. Las herramientas genéticas disponibles para la investigación de Arabidopsis permiten el análisis molecular de las Ca2 + señales medido por GCaMP3. Además, el biosensor de GCaMP3 puede verse bajo un microscopio de fluorescencia en lugar de un sistema confocal más costoso. Este protocolo permite que todo tejido imágenes, indispensable cuando se realizan experimentos con estrés bióticos vivo. El experimento está diseñado de tal forma que hojas desprendidas de las plantas 35S::GCaMP3 se flotaban en el agua, para evitar fuga de insectos y restringir la alimentación a un tejido específico. El método descrito en este documento, por tanto, permite el análisis de la hoja dinámica de Ca2 + durante la alimentación por M. persicae, dando por resultado la caracterización de una planta nueva señalización de la respuesta. Este método también puede ser adaptado para trabajar con otros estreses bióticos, como otras especies de insectos y patógenos microbianos y otros tejidos de la planta, como raíces.
El método descrito en este trabajo permite el análisis en tiempo real de la planta Ca2 + señalización durante un estrés biótico tales como alimentación de insectos. Demuestra que una de las primeras respuestas de la planta a estas amenazas es una localizada [Ca2 +]cyt elevación alrededor del sitio de alimentación del insecto. Mediante el uso de mutantes, este método permitirá la caracterización molecular y fisiológica de dichas señales, que no era previamente posible. Un paso crítico en este protocolo es asegurar que las hojas desprendidas no son excesivamente alteradas durante el proceso de separación (paso 3.2) o al transferir insectos a las hojas (paso 4.5). Dado que el protocolo actual proporciona una medida relativa de [Ca2 +]cyt en lugar de una concentración absoluta, es vital que la configuración del microscopio se mantiene constante durante todo el experimento. También existe el potencial para sesgo humano durante la selección de ROIs y el análisis de los datos, y como tal, se recomienda que se llevan a cabo los experimentos de doble ciego.
Hay varias ventajas de la medición [Ca2 +]cyt durante estrés biótico con este protocolo. En primer lugar, el uso de un fluoróforo solo con un alto rendimiento fluorescente permite la proyección de imagen a realizar en un estereomicroscopio, que es menos costosa que el uso de un microscopio confocal. El uso de un fluoróforo solo también simplifica el análisis y recopilación de datos, ya que hay una sola medida para grabar. Además, la utilización de un estereomicroscopio permite la proyección de imagen de hojas enteras, que es esencial dado que muchas de las interacciones bióticas, incluyendo las interacciones planta-pulgón, ocurren en una escala espacial grande. La alta resolución temporal de imagen captura posible con GCaMP3, basado en la disociación rápida de Ca2 + del sensor después de enlace23,30 y el alto rendimiento fluorescente, permite que las medidas a tomar hasta cada 5 s. Además, el análisis foliar previene el escape del insecto, una clave limitando el paso a la realización de experimentos en plantas enteras (en preparación). Las hojas desprendidas también aseguran de que el insecto se alimenta desde un lugar previamente definido, permitiendo el análisis de Ca2 + dinámica antes, durante y después de la alimentación. Este protocolo también se asegura de que hojas de etapas de desarrollo similares se utilizan para el análisis.
La principal desventaja de este protocolo se origina el uso de un biosensor no proporcionales. Con solo FP biosensores, variación en la emisión de GFP puede resultar de variables experimentales distintos de [Ca2 +]cyt, como cambios en el pH celular, el movimiento o el nivel de expresión del biosensor. Estos temas no se encuentran con Cameleons traste en traste, como la transferencia de energía de PPC a YFP sólo ocurre al enlace de Ca2 + . Otras condiciones que alteran las propiedades fluorescentes de los fluoróforos individual están poco probable que imitan los cambios opuestos en intensidad del CFP y de YFP y el cálculo radiométrica que es inherentemente normaliza las mediciones para muchos de estos otros artefactos ópticos23,30. Esto hace más confiable con traste Cameleons estimaciones de absoluta [Ca2 +]cyt . Por lo tanto, GCaMP3 se utiliza mejor como un biosensor para medir la relativa [Ca2 +]cyt, aunque es todavía suficiente para detectar y caracterizar fenómenos biológicos en las plantas5,(in preparation). Por lo tanto, es esencial utilizar los controles para mostrar que el efecto observado es debido a la Ca2 +, incluyendo Ca2 +-relacionados con la genética mutantes(en preparación) o farmacológicas Ca2 + canal inhibidores como La3 + . Lo importante, solo FP biosensores típicamente mostrar un mayor rendimiento fluorescente y mayor rango dinámico (es decir, un aumento de floración sobre enlace de Ca2 + ) que traste Cameleons23, que la hace más adecuada para GCaMP nivel de tejido la proyección de imagen, mientras que traste Cameleons son una herramienta útil para la proyección de imagen celular con un microscopio confocal5,25.
Durante la ejecución de este protocolo, es posible que algunos problemas que requieren solución de problemas surgirán. Por ejemplo, se recomienda que las muestras en las que la muestra de hoja de control (sin tratamiento) son grandes elevaciones decyt [Ca2 +] descartados (paso 6.3). Estos transitorios son probablemente el resultado de estrés inducido por la microscopia. De hecho, la luz azul se conoce para obtener la Ca2 + señales de38,39,40,41, y la luz de alta intensidad podría también resultar en temperatura y estrés osmóticos, los cuales también provocan [Ca2 +]cyt elevaciones21,del25,42. En consecuencia, para reducir esas tensiones, es importante para realizar el experimento en una habitación bien ventilada y con temperatura controlada y evitar Tiempos de exposición innecesariamente largas. También es importante no alterar demasiado las hojas durante la separación o la microscopia para evitar que toque sacada [Ca2 +]cyt elevaciones43,44,45. Problemas pueden encontrarse también con colocar insectos. Con M. persicae, los insectos no colocar en las hojas en varias muestras. Esto podría ser el resultado de defensa produce heridas en las hojas desprendidas46,47, o la perturbación de los insectos por la luz azul. De hecho, visión en M. persicae se rige por tres fotorreceptores, uno de ellos con una sensibilidad máxima de 490 nm48. Reducir la exposición de microscopía y manejo de los áfidos con cuidado pueden reducir la angustia y alentar a resolver.
El protocolo descrito en el documento actual le da nuevas perspectivas en la comprensión molecular de las interacciones planta-insecto y la respuesta de la planta al estrés biótico. Permite la visualización de una de las primeras respuestas de la planta para alimentarse de insectos y facilita aún más las investigaciones mediante el uso de las considerable Arabidopsis recursos genéticos disponibles. Además, este protocolo permite el uso de organismos vivos, como los extractos de49 o elicitores50. En el futuro, esta técnica podría aplicarse a otros estreses bióticos, como otras especies de insectos, nemátodos y patógenos microbianos, así como a estreses abióticos. La microscopía de GCaMP3 puede modificarse también para otros tejidos de la planta, alternativa ROIs en la hoja, o plantas incluso toda la imagen. Además, existe el potencial para el biosensor que genéticaly en especies adicionales. En consecuencia, el protocolo descrito en este artículo tiene el potencial encubierto la base molecular de Ca2 + en una variedad de nuevas interacciones bióticas entre las plantas y otras especies.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) para el Consejo sobre microscopía. Los autores también desean agradecer a los departamentos de Entomología por su asistencia y John Innes Centre hortícola. Este trabajo fue financiado por una beca de doctorado de la Fundación John de Innes (T.V.), donación de B/JJ004561/1 de la BBSRC y la Fundación de John Innes (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. y D.S.), un año en colocación de industria de la John Innes Centre (M.A.) , una beca de verano de la sociedad bioquímica de la UK (J.C.), JST PRESTO (M.T.) y subvenciones MCB 1329723 y IOS 1557899 de la National Science Foundation (M.T. y S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |