Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre
Summary
Una nueva generación de plataformas de transcripción-traducción libre de la célula ha sido diseñada para la construcción de sistemas bioquímicos en vitro a través de la ejecución de circuitos de gene. En este artículo describimos cómo bacteriófagos como MS2, ΦΧ174 y T7, son sintetizados a partir de su genoma mediante un todo e. coli sin células TXTL sistema.
Abstract
Una nueva generación de sistemas libres de células transcripción-traducción (TXTL), diseñado para tener una mayor versatilidad y modularidad, proporcionar nuevas capacidades para ciencias básicas y aplicadas en reacciones de tubo de ensayo. En la última década, TXTL libres de células se ha convertido en una técnica poderosa para una amplia gama de la biología relacionados con cuantitativa y sintética de áreas nuevas investigaciones multidisciplinarias. Las nuevas plataformas TXTL son particularmente útiles para construir e interrogar a sistemas bioquímicos a través de la ejecución de circuitos gen sintético o natural. In vitro TXTL ha demostrado conveniente rápidamente elementos reguladores del prototipo y redes biológicas así que recapitulemos molecular autoensamblaje mecanismos encontraron en los sistemas vivos. En este artículo describimos cómo infecciosos bacteriófagos, como el MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) y T7 (dsDNA), son sintetizados totalmente de su genoma en las reacciones de un pote con Escherichia coli, un sistema libre de células TXTL. Síntesis de los tres colífagos se cuantifican utilizando el ensayo de placa. Mostramos cómo la producción de fagos sintetizada depende de los parámetros bioquímicos de las reacciones. Hacinamiento molecular, emulado a través de una concentración controlada de PEG 8000, afecta a la cantidad de fagos sintetizadas por órdenes de magnitud. También describimos cómo amplificar los phages y purificar sus genomas. El conjunto de protocolos y resultados presentados en este trabajo debe ser de interés para los investigadores multidisciplinarios involucrados en Bioingeniería y biología sintética sin células.
Introduction
En la última década, la tecnología de libre expresión ha sido diseñada para aplicaciones novedosas de dirección en biología relacionados con sintético y cuantitativa de áreas emergentes de investigación multidisciplinar. Originalmente utilizado para expresar las proteínas de un organismo vivo, se han desarrollado nuevos sistemas acelulares de TXTL para ambas ciencias básicas y aplicadas1,2, ampliar considerablemente el alcance de esta tecnología. La nueva generación de plataformas TXTL ha sido diseñada para ser fácil de usar, más eficiente (llegar a 2 mg/mL de síntesis de proteínas en modo batch3), más versátil a nivel de transcripción4y modular para integran fácilmente novela natural o funciones sintéticas que amplían las capacidades de los sistemas biológicos5,6. En particular, sistemas TXTL libres de células se han convertido en útiles para la creación rápida de prototipos de programas genéticos, tales como elementos reguladores o pequeños circuitos genéticos7,8,9, mediante la reducción de la prueba de diseño-construcción ciclo a unos pocos días. Sorprendentemente, los nuevos sistemas TXTL también son capaces de procesar grandes programas de ADN como la síntesis completa de colífagos10,11, demostrando fuerte suficientes prestaciones para apoyar la reconstitución del activo genómica DNA codificadas entidades vivientes.
TXTL sistemas presentan muchas ventajas técnicas en comparación con el tradicional en vitro constructivo ensayos bioquímicos. Sin células TXTL vincula el proceso de la expresión génica al producto final en un ambiente reducido y abierto, en comparación con el complejo citoplasma de una célula viva. TXTL usa ADN para reconstruir sistemas bioquímicos en vitro, que, con modernas técnicas de la Asamblea de ADN, es asequible y rápido además de no requerir pasos de purificación de proteína fastidioso. Expresión libre de la célula proporciona acceso directo a la mayoría de los componentes de las reacciones bioquímicas, lo que permite una disección más profunda de las interacciones moleculares12. En una reacción TXTL, uno puede cambiar los ajustes bioquímicos y biofísicos en la voluntad, que es casi imposible en una célula viva. Teniendo en cuenta estas ventajas y mejoras recientes, la tecnología TXTL se está convirtiendo en cada vez más popular como una plataforma alternativa para la biología sintética y cuantitativa. Mientras que la comunidad de investigación usando TXTL está creciendo rápidamente y TXTL se está convirtiendo en una tecnología estándar de la bioingeniería, es esencial para entender cómo utilizar las plataformas para el desarrollo de prácticas apropiadas y relacionadas con la ejecución de reacciones TXTL y a la interpretación de los resultados.
En este artículo se describe cómo utilizar un sistema TXTL todos de e. coli para sintetizar, en una olla reacciones, bacteriófagos de su genoma11, como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) y el T7 (dsDNA, 40 kb). Nos muestran cómo la cantidad de fagos había sintetizado cambios con respecto a algunos de los valores bioquímicos de las reacciones (concentraciones de magnesio y potasio). Hacinamiento molecular, emulado a través de una gama de PEG 8000 concentraciones, tiene un efecto dramático sobre la síntesis de fago en varios órdenes de magnitud. La realización de estos grandes sistemas bioquímicos en reacciones de simple tubo de ensayo que recapitulan simultáneamente los procesos de transcripción, traducción y uno mismo-Asamblea, es interesante para abordar preguntas básicas relacionadas con la biología y Biofísica 10 (regulación de los genes, uno mismo-Asamblea), así como para el desarrollo de aplicaciones, tales como reasignación de funciones del fago para construir nuevas nanoestructuras13. Además de un práctico en TXTL, ofrecemos métodos de amplificación de fago, extracción de genoma y purificación y cuantificación de fago por el ensayo de placa. Los métodos presentados en este manuscrito son apropiados para los investigadores que usan sistemas de sin células de e. coli extracto basado en y están interesado en bacteriófagos.
Los protocolos presentados en este trabajo se pueden resumir como sigue: amplificación 1) Phage (día 1: inoculación de preparar células, día 2: solo placa múltiple phage y concentración y el crecimiento día 3: purificación de fagos), 2) extracción de ADN de genoma Double-stranded (extracción de fenol/cloroformo) y 3) experimento de título y reacción de fagos libres de células (día 1: placa las células del huésped y hacer las placas de agar, día 2: reacción libre y anfitrión célula precultivo y día 3: título cultura y phage célula del anfitrión).
Protocol
Representative Results
Discussion
Siguiendo la técnica de Chen, et al. 14 para SPMC, un paso crítico se alcanza al determinar las condiciones adecuadas para la sobreinfección. El parámetro que mejor controla la habilidad de una cepa de host para soportar el superinfection con frecuencia es la concentración inicial de la infección phage. Las células hospedadoras deben estar en fase de crecimiento logarítmico antes de la infección inicial con una pequeña cantidad de fagos. Finalmente, los fagos también alcanzará…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material está basado en trabajo apoyado por el Oficina de investigación Naval Premio número N00014-13-1-0074 (V.N.), el programa de Ciencias humanas de frontera número RGP0037/2015 de la concesión (a V.N.) y la Fundación binacional de ciencia concede 2014400 (a V.N.).
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
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