에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템
Summary
셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
셀 무료 전사-번역 (TXTL) 시스템, 더 큰 다양성 및 모듈화, 테스트 튜브 반응에서 기초 및 응용 과학을 수행 하기 위해 새로운 기능을 제공 하기 위해 설계 된의 새로운 세대. 지난 10 년간, TXTL 셀 무료 소설 종합 연구 분야 관련된 양적 및 합성 생물학의 광범위 한 범위에 대 한 강력한 기술 되고있다. 새로운 TXTL 플랫폼은 생성 하 고 합성 또는 자연 유전자 회로 실행을 통해 생화학 시스템 심문 특히 유용 합니다. 생체 외에서 TXTL 입증 정리로 빠르게 프로토 타입 규제 요소와 뿐만 아니라 생물 네트워크에 편리한 메커니즘 생활 시스템에서 발견 하는 자기 조립 분자. 이 문서에서 설명 하는 어떻게 전염 성 살 균 소, 등 MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), 그리고 T7 (dsDNA), 전적으로 모든 대장균, 셀 프리 TXTL 시스템을 사용 하 여 한 냄비 반응에 그들의 게놈에서 합성 됩니다. 3 coliphages의 합성 상 패 분석 결과 사용 하 여 정량 이다. 우리는 합성된 살 균 소의 수확량 반응의 생 화 확 적인 설정에 따라 결정 하는 방법을 보여줍니다. 던지다 8000의 제어 집중을 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, magnitudes의 명령에 의해 합성된 페이지의 금액에 영향을 줍니다. 우리는 또한는 페이지를 증폭 하는 방법 및 그들의 게놈을 정화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 및이 작품에서 제시 하는 결과 집합이 셀 무료 합성 생물학 및 생명 공학에 종합 연구 참여에 대 한 관심의 이어야 한다.
Introduction
지난 10 년간, 셀 무료 식 기술 긴급 종합 연구 분야 관련 합성 및 양적 생물학에서 주소 새로운 응용 프로그램을 설계 되었습니다. 원래 독립적인 생명체의 단백질을 표현 하는 데 사용, 새로운 셀 무료 TXTL 시스템 모두 기초 및 응용 과학1,2, 상당히이 기술의 범위 확대에 대 한 개발 되었습니다. TXTL 플랫폼의 새로운 세대는 사용자 친화적인, 수 있도록 설계 되었습니다 더 효율적 (도달 배치 모드3에서 단백질 합성의 2 mg/mL), 더 전사4의 수준에서 다양 하 고 게로 이렇게 모듈형 쉽게 통합 자연 소설 또는 기존 생물 학적 시스템5,6의 기능을 확장 하는 합성 함수. 특히, TXTL 시스템 셀 무료 되 규제 요소 등 작은 유전자 회로7,,89, 유전 프로그램의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리한 디자인-빌드-테스트를 줄여 몇 일을 주기. 놀랍게도, 새로운 TXTL 시스템은 또한 큰 DNA coliphages10,11, 강한 활성 게놈의 재구성을 지원 하기 위해 충분 한 성과 보여주는 완벽 한 종합 프로그램을 처리할 수 DNA는 생활 엔티티 인코딩됩니다.
TXTL 시스템 전통적인 생체 외에서 건설적인 생 화 확 적인 분석 실험에 비해 많은 기술적인 장점을 제시. 셀-무료 TXTL 살아있는 세포의 복잡 한 세포질 반대로 감소 하 고 오픈 환경에서 최종 제품에 유전자 발현의 과정을 연결합니다. TXTL DNA를 사용 하 여, 현대 DNA 조립 기술,는 저렴 하 고 빠른 까다로운 단백질 정화 단계를 요구 하지 않는 뿐만 아니라 생화학 시스템에 생체 외에서재구성. 셀-무료 식 대부분의 생 화 확 적인 반응, 따라서12분자 상호 작용 깊은 해 부를 수 있도록 구성 요소에 대 한 직접 액세스를 제공 합니다. TXTL 반응에서 거의 불가능 한 살아있는 세포에 자유로이 생화학 및 생물 설정을 변경할 수 하나. 이러한 장점과 최근 개선을 감안할 때, TXTL 기술 합성 및 양적 생물학에 대 한 대체 플랫폼으로 더 많은 인기 되고있다. TXTL를 사용 하 여 연구 커뮤니티는 빠르게 성장 하는 동안 TXTL 바이오에 표준 기술 되 고, 그것은 TXTL 반응의와 실행에 관련 된 적절 한 전략을 개발할 수 있도록 같은 플랫폼을 사용 하는 방법을 이해 필수적입니다는 결과의 해석입니다.
이 문서에서는, 우리 모든 대장균 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈11, MS2 같은 살 균 소를 한 냄비 반응에서 합성 하는 방법을 설명 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), 및 T7 (dsDNA, 40 kb). 우리는 페이지의 금액 반응 (마그네슘과 칼륨 농도)의 생 화 확 적인 설정의 일부에 관하여 변화를 합성 하는 방법을 보여줍니다. 말뚝의 범위 8000 농도 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, 여러 자릿수로 이상 살 균 소 합성에 극적인 효과가. 동시에 전사, 번역의 과정을 정리 하 고 자기 조립, 생물학 및 물리학에 관련 된 기본적인 질문을 해결 하기 위한 흥미롭습니다 단일 테스트 튜브 반응에서 이러한 큰 생화학 시스템의 실현 10 (유전자 규칙, 자기 조립), 뿐만 아니라 새로운 nanostructures13구축 페이지 기능을 재사용 하는 등 응용 프로그램 개발에. TXTL에는 실용적, 뿐만 아니라 우리 패 분석 실험에 의해 살 균 소 증폭, 게놈 추출 및 정화, 살 균 소 정량화 방법 제공합니다. 이 원고에 표시 메서드에 대장균 추출 기반 셀 자유로운 시스템을 사용 하 고 살 균 소에 관심이 연구원에 적합 합니다.
이 작품에서 제시 하는 프로토콜은 다음과 같이 요약 될 수 있다: 1) 살 균 소 확대 (주 1: 접종 준비 세포, 주 2: 플 라크, 여러 살 균 소 성장, 고 농도, 및 3 일: 살 균 소의 정화), 2) 더블-좌초 게놈 DNA 추출 (페 놀/클로 프롬 추출), 3) 셀 무료 살 균 소 반응과 titer 실험 (주 1: 호스트 셀 접시 고 한 천 배지, 주 2: 셀 무료 반응 하 고 호스트 세포 사전 문화, 그리고 하루 3: 호스트 셀 문화 및 살 균 소 titer).
Protocol
Representative Results
Discussion
첸, 그 외 에 기술에 따라 SPMC에 대 한 14 , superinfection 적절 한 조건을 결정할 때 중요 한 단계에 도달입니다. 가장 가깝게 superinfection 견딜 호스트 스트레인의 능력을 제어 하는 매개 변수 자주 감염 살 균 소의 초기 농도 이다. 호스트 세포는 살 균 소의 아주 작은 금액을 초기 감염 전에 대 수 성장 단계에 있어야 합니다. 결국, 페이지 또한 로그 성장을 도달 하 고 목표 살 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 자료는 해군 연구 사무실 보너스 번호 N00014-13-1-0074 (V.N.)를 지 원하는 작업을 기반으로, 인간 프론티어 과학 프로그램 부여 번호 RGP0037/2015 (V.N.), 그리고 한국군 과학 재단 부여 2014400 (V.N.).
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
Referências
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