这篇手稿描述了如何区分不同的线虫使用远场衍射签名。我们比较了139种野生类型和 108 “滚子” C. 线虫的运动, 通过平均频率与瞬时霍夫费衍射签名在一个位置使用连续波激光。
这篇手稿描述了如何使用世俗远场衍射特征对线虫进行分类。单个C. 线虫悬浮在光学试管内的水柱中。632 nm 连续波氖激光器是通过试管使用前表面反射镜。在光线穿过试管后, 至少有20-30 厘米的距离可以确保一个有用的远场 (弗劳恩霍夫) 衍射图样。当线虫在激光束内游动时, 衍射模式会发生实时变化。光电二极管被放置在衍射图样的偏心位置。光电二极管的电压信号是实时观测的, 并使用数字示波器记录。此过程重复139野生类型和 108 “滚子” C. 线虫。野生型蠕虫在溶液中表现出快速振荡模式。”滚子” 蠕虫有一个突变的角质层的关键组成部分, 干扰平滑的运动。不含饱和度和不活动的时间间隔将被丢弃。将每个平均值除以其最大值以比较相对强度是可行的。每个蠕虫的信号是傅里叶变换, 使每个蠕虫的频率模式出现。每种类型的蠕虫的信号都是平均的。对野生类型和 “滚子”线虫的平均傅里叶谱进行了明显的区别, 揭示了两种不同的蠕虫病毒的动态蠕虫形态可以用傅立叶分析来区分。每个蠕虫应变的傅里叶谱匹配一个近似模型使用两个不同的二进制蠕虫形状对应于运动时刻。实际和模拟蠕虫的平均频率分布的包络确认模型与数据匹配。这种方法可以作为许多微观物种的傅里叶分析的基线, 因为每个微生物都有其独特的傅里叶谱。
该方法比较了两种不同运动模式的菌株的实验和模拟的频率谱. 结果表明, 当线虫在水柱中游动时, 频谱依赖于时间变化, 因此不需要清晰的显微图像进行分析。此方法允许定量 real-time 分析, 并提供与传统显微镜获得的图像/视频的补充信息。弗劳恩霍夫衍射, 也称为远场衍射, 为获得活衍射数据提供了依据1,2。在衍射图样的任何一个点上的光强度是从线虫的轮廓中的每一点的叠加光的结果3。因此, 随着时间的推移收集的光强度携带的信息关于线虫的运动。分析了随时间推移的衍射信号可以识别出相应突变体的特征运动, 因为分析了运动中涉及的所有频率, 补充了传统的视频分析。在这种情况下, 通过比较两种不同菌株的频率谱, 证实了 “滚子” 与野生型线虫的运动之间的特征差异。
一些以前的特征已被证实使用频率分析的衍射信号, 如游泳频率2,4。更重要的是, 这种方法可以作为传统显微镜的一种补充方法, 在收集数据的同时, 在计算机屏幕上实时观察运动。通过考虑衍射信号的傅里叶变换信号, 可以对具有不同运动模式的蠕虫的频谱进行量化。
Fourier-based 衍射在这项工作中的多学科性质涉及生物学和物理领域。在生物的晶体结构的研究中, 长期使用的衍射在生物学5和其他领域。然而, 在这个实验中, 采样6,7创建了远场衍射模式, 使生物体以激光束为中心。采样通常用于与重建原始对象的图像的相位检索算法相结合的无透镜成像8 。当散射像线虫那样存在时, 相位检索很难实现。时间衍射特征足以评估蜗杆运动的关键频率。这种方法是较少的计算征税和提供一种光学的方式来量化的运动。这项技术可以很容易地被改编为分析突变或环境条件, 改变行为。
包括不活动的数据的延伸将扭曲结果, 因为人工较低的频率将被平均纳入结果。在原始数据中, 可以通过平坦峰值或 “切断” 峰值来识别光电二极管的饱和。按峰值强度划分每个原始数据将有助于计算激光强度的波动。
峰值频率是总颠簸频率的指示器;然而, 复杂的运动会引起衍射图样中跳动频率的干扰, 需要仔细检查。
该方法可用于研究其他线虫的运动。可以将环境更改为其他媒体。波长也可能改变。工作在可见光范围内的电磁波谱是最简单和最安全的。
更精确的模型将在未来更真实地模拟衍射光谱。未来的模型可能包括可以改变方向的蠕虫, 这不会影响频率位置, 而是相对峰值高度。一个更现实的模型将允许概率分布的颠簸频率, 这将扩大峰值的实验数据。频率的传播会考虑到颠簸频率的变化。
当前的蠕虫形状是粗的, 特别是在头部和尾部区域, 这应该比目前的模型更锥形。对信号的时间序列进行详细的分析可能会很有趣, 因为它可以给出不同突变体的运动复杂性的线索。
将该技术推广到同时对多线虫进行定性是值得考虑的。这种方法应该被理解为使用传统显微镜的现有方法的一种补充方法。这种方法在数据获取过程中不需要显微镜, 因此蠕虫可能会移出焦平面。平均频率谱在蜗杆运动中显示出明显的差异, 并可通过流行的频率峰值进行量化, 这是一种新的定量的蠕虫运动方法。衍射特征的数据分析正在进一步发展, 并有望导致多个突变体和个体的自动识别过程。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢胡安。我们感谢瓦萨大学本科生研究暑期研究所 (熊胆)、露西-梅纳德三文鱼研究基金和 NSF 奖 No. 1058385 的支持。
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