Dette manuskript beskriver hvordan man skelner forskellige nematoder langt-ager diffraktion signaturer. Vi sammenligner bevægelse af 139 vildtype og 108 “Roller” C. elegans af gennemsnit frekvenser tilknyttet den tidsmæssige Fraunhofer diffraktion underskrift på en enkelt placering ved hjælp af en kontinuerlig bølge laser.
Dette manuskript beskriver, hvordan du klassificere nematoder tidsmæssige langt-ager diffraktion signaturer. En enkelt C. elegans er suspenderet i en vandsøjle inde en optisk kuvette. En 632 nm kontinuert bølge HeNe laser er instrueret gennem kuvette ved hjælp af forreste overflade spejle. En væsentlig afstand på mindst 20-30 cm rejste efter lyset passerer gennem kuvette sikrer en nyttig langt-ager (Fraunhofer) diffraktionsmønster. Diffraktion mønster ændringer i realtid som fyrretræsnematoden svømmer i laserstrålen. Fotodiode er placeret off-center i diffraktionsmønster. Spænding signalet fra fotodiode er observeret i realtid og registreres ved hjælp af et digitalt oscilloskop. Denne proces gentages for 139 vildtype og 108 “roller” C. elegans. Vildtype orm udviser en hurtig svingning mønster i løsning. “Roller” orme har en mutation i et nøgleelement i hårstrået, der forstyrrer jævn bevægelse. Tidsintervaller, der ikke er fri af mætning og inaktivitet er kasseret. Det er praktisk at opdele hver gennemsnit af sin maksimale at sammenligne relative intensiteter. Signal for hver orm er Fourier ændret således at frekvens mønster for hver orm fremgår. Signal for hver type af ormen er gennemsnit. Gennemsnit Fourier spektrene for vilde og “roller” C. elegans er tydeligt forskellige og afslører, at figurerne dynamisk orm af de to forskellige orm stammer kan adskilles ved hjælp af Fourieranalyse. Fourier spektrene for hver orm stamme matche en tilnærmet model ved hjælp af to forskellige binære orm figurer, der svarer til bevægelsesadfærd øjeblikke. Kuvert af den gennemsnit hyppighed distribution til faktiske og modellerede orme bekræfter modellen svarer til dataene. Denne metode kan tjene som en baseline til Fourier analyse for mange mikroskopiske arter, som hver mikroorganisme får sin unikke Fourier spektrum.
Denne metode sammenligner eksperimentelle og modellerede frekvens spektre af bevægelse af C. elegans ved hjælp af to stammer med meget forskelligt bevægelsesadfærd mønstre. Resultaterne viser, at frekvensspektret afhænger af tidsmæssige ændringer som fyrretræsnematoden svømmer i en vandsøjle, således at klare mikroskopiske billeder ikke er behov for analyse. Denne metode giver mulighed for kvantitative real-time analyse og giver supplerende oplysninger til billeder/videoer opnås med traditionelle mikroskoper. Fraunhofer diffraktion, også kaldet langt-ager diffraktion, danner grundlag for at opnå levende diffraktion data1,2. Lysintensiteten på et enkelt punkt i diffraktionsmønster er resultatet af sammenføje lys fra hvert punkt i omrids af nematodeprøveudtagning3. Som følge heraf bærer lysintensiteten indsamlet over tid information om bevægelse af fyrretræsnematoden. Analysere tidsafhængig diffraktion signal kan identificere den karakteristiske bevægelse af de tilsvarende mutant da analysere alle de frekvenser, der er involveret i bevægelse supplerer de traditionelle video analyse. I dette tilfælde bekræftes de karakteristiske forskelle mellem bevægelse “rulle” og vildtype C. elegans ved at sammenligne hyppighed spektrene for to forskellige stammer af fyrretræsnematoden.
Nogle tidligere egenskaber er blevet bekræftet ved hjælp af frekvens analyse af diffraktion signaler såsom svømning frekvenser2,4. Vigtigere er, kan denne metode bruges som en supplerende metode til traditionelle mikroskopi for at observere bevægelse i realtid på en computerskærm, som dataene indsamles. Frekvensspektrum af orme med særskilte bevægelsesadfærd mønstre kan kvantificeres ved at betragte Fourier omdannet signal af diffraktion signal.
Den tværfaglige natur af Fourier-baserede diffraktion i dette arbejde involverer inden for biologi og fysik. Diffraktion af under prøvetagning har længe været anvendt til at undersøge krystal strukturer i biologi5 og andre felter. I dette eksperiment skaber oversampling6,7 , langt-ager diffraktionsmønster, således at organismen er centreret i laserstrålen. Oversampling bruges typisk til linse-mindre billedbehandling8 sammenholdt med en fase hentning algoritme, der rekonstruerer et billede af det oprindelige objekt. Fase hentning er vanskelig at opnå, når scatterers er til stede som er tilfældet med en nematode. Den tidsmæssige diffraktion signatur er nok til at vurdere centrale frekvenser af ormen bevægelse. Denne metode er mindre beregningsmæssigt beskatning og giver en optisk måde at kvantificere locomotion. Denne teknik kan let tilpasses til analyse af mutationer eller miljømæssige forhold, der ændrer adfærd.
Herunder strækninger af data med inaktivitet vil forvrænge resultater, da kunstig lavere frekvenser vil være gennemsnit i resultaterne. Mætte fotodiode kan genkendes af flade toppe eller “cut off” toppe i de rå data. Dividere hvert rå datasæt med peak intensiteter vil hjælpe med regnskab for udsving i laser intensitet.
De højeste frekvenser er en indikator for samlet prygl frekvens; dog kompliceret bevægelse forårsager interferens på beat frekvenser i diffraktionsmønster og skal undersøges nøje.
Denne metode kan bruges til at undersøge bevægelse af andre nematoder. Miljøet kan ændres til et andet medium. Bølgelængder kan ændres så godt. Arbejder i det synlige spektrum af det elektromagnetiske spektrum er nemmeste og sikreste.
En mere raffineret model vil simulere diffraktion spectra mere realistisk i fremtiden. En fremtidig model kan omfatte en orm, der kan ændre retningslinjer, som ikke ville påvirke hyppigheden steder men relative toparealer. En mere realistisk model ville muliggøre en probabilistisk fordeling af prygl frekvenser, som ville udvide toppe i eksperimentelle data. Et opslag i frekvenser ville tegne sig for variationer i prygl frekvenser.
Den aktuelle orm figur er rå, især i regionen hoved og hale, der bør være mere tilspidset end i den nuværende model. Det kan være interessant at foretage en detaljeret analyse af tidsserier af signalet, da det kunne give fingerpeg om kompleksiteten af bevægelse i forskellige mutanter.
Det er værd at overveje den praktiske gennemførlighed af udvide denne teknik til kendetegner flere nematoder samtidigt. Denne metode bør forstås som en supplerende metode til eksisterende metoder ved hjælp af traditionelle mikroskoper. Denne metode har en fordel i der ikke kræver et mikroskop under dataopsamling, så ormen kan flytte ud af brændplanet. Gennemsnit frekvens spectra viser tydelige forskelle i orm bevægelse og kan kvantificeres ved de fremherskende frekvens toppe, som er en roman metode i kvantificere orm locomotion. Dataanalyse af diffraktion signaturer er i yderligere udvikling og forhåbentlig vil føre til en automatiseret identifikation flere mutanter og enkeltpersoner.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Juan Vasquez for hans beregningsmæssige bidrag med dette projekt. Vi er taknemmelige for støtte fra Vassar College bachelor forskning Summer Institute (URSI), Lucy Maynard laks forskningsfond og NSF award No. 1058385.
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Fig. 4 |
Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |