Detta manuskript beskriver hur att skilja olika nematoder använder långt-fältet diffraktion signaturer. Vi jämför förflyttningen av 139 vildtyp och 108 ”Roller” C. elegans av genomsnitt frekvenser som är kopplat till den tidsmässiga Fraunhofer diffraktion signaturen på en enda plats med hjälp av en kontinuerlig våg laser.
Detta manuskript beskriver hur att klassificera nematoder använder temporal långt-fältet diffraktion signaturer. En enda C. elegans är upphängd i en vatten kolumn inuti en optisk kyvetten. 632 nm kontinuerlig våg HeNe laser dirigeras via den kyvetten med hjälp av främre ytan speglar. Ett betydande avstånd på minst 20-30 cm reste efter ljuset passerar genom kyvetten säkerställer ett användbart långt-fältet (Fraunhofer) diffraktionsmönster. Diffraktion mönster förändringarna i realtid som Nematoden simmar inom laserstrålen. Fotodioden placeras off-center i mönstret diffraktion. Spänning signalen från fotodioden observeras i realtid och registreras med en digital oscilloskop. Denna process upprepas för 139 vildtyp och 108 ”roller” C. elegans. Vildtyp maskar uppvisar en snabb svängning mönster i lösning. ”Roller” maskar har en mutation i en nyckelkomponent i nagelbanden som stör smidig förflyttning. Tidsintervall som inte är fria för mättnad och inaktivitet ignoreras. Det är praktiskt att dela upp varje genomsnittet av dess maximum att jämföra relativ intensitet. Signalen för varje mask är Fourier omvandlas så att frekvensmönstret för varje mask framträder. Signalen för varje typ av mask är i genomsnitt. I genomsnitt Fourier spektra för vilda typ och ”rullen” C. elegans är påtagligt annorlunda och avslöja att dynamisk mask formerna av de två olika mask-stammarna kan särskiljas med hjälp av Fourier-analys. Fourier spektra av varje mask stam matcha en ungefärlig modell med två olika binära mask former som motsvarar motoriskt stunder. Kuvertet av den i genomsnitt frekvensfördelningen för faktiska och modellerade maskar bekräftar modellen matchar data. Denna metod kan fungera som en baslinje för Fourier-analys för många mikroskopiska arter, eftersom varje mikroorganism måste dess unika Fourier-spektrum.
Denna metod mäter med experimentella och modellerade frekvensdiagram för en förflyttning av C. elegans med två stammar med mycket olika motoriskt mönster. Resultaten visar att frekvensspektrum beror på tidsmässiga förändringar som Nematoden simmar i en vattenpelare så att tydliga mikroskopiska bilder inte behövs för analys. Denna metod möjliggör kvantitativa analys i realtid och ger kompletterande information till bilder/video erhålls med traditionella Mikroskop. Fraunhofer diffraktion, även kallad långt-fältet diffraktion, grunden för att få levande diffraktion data1,2. Ljusintensiteten på någon enda punkt i mönstret diffraktion är resultatet av överlagras ljus från varje punkt i dispositionen av nematoder3. Som ett resultat, bär ljusintensiteten samlat in över tiden information om förflyttningen av Nematoden. Analysera den tidsberoende diffraktion signalen kan identifiera den karakteristiska motion motsvarande muterade eftersom analysera alla frekvenserna som är inblandade i locomotion kompletterar de traditionella videoanalys. I det här fallet bekräftas de karakteristiska skillnaderna mellan locomotion ”rullen” och vilda typ C. elegans genom att jämföra frekvens spektra av de två olika stammarna av Nematoden.
Några tidigare egenskaper har bekräftats med hjälp av frekvensanalys av diffraktion signaler såsom simning frekvenser2,4. Viktigare, kan denna metod användas som en kompletterande metod för att traditionella mikroskopi för att följa förflyttning i realtid på en datorskärm som data samlas in. Frekvensspektret av maskar med distinkta motoriskt mönster kan kvantifieras genom att betrakta Fourier omvandlas signal av diffraktion signalen.
Den tvärvetenskapliga karaktären av Fourier-baserade diffraktion i detta arbete innefattar områdena biologi och fysik. Diffraktion av under provtagning har länge använts för att undersöka kristallen strukturerar i biologi5 och andra områden. I detta experiment skapar översampling6,7 dock det lång-fältet diffraktion mönstret så att organismen är centrerad i laserstrålen. Översampling används vanligtvis för lins-mindre imaging8 i samband med en fas hämtning algoritm som rekonstruerar en bild av det ursprungliga objektet. Fas hämtning är svårt att uppnå när scatterers är närvarande som är fallet med en nematod. Temporal diffraktion signaturen är tillräckligt för att utvärdera viktiga frekvenser av förslaget mask. Denna metod är mindre beräkningsmässigt beskatta och ger en optisk sätt att kvantifiera locomotion. Denna teknik kan lätt anpassas för analys av mutationer eller miljöförhållanden som förändrar beteende.
Inklusive sträckor av data med inaktivitet kommer att förvränga resultaten eftersom konstgjorda lägre frekvenser kommer att vara i genomsnitt i resultaten. Mättar fotodioden kan kännas igen av platta toppar eller ”skära av” toppar i rådata. Dividera varje raw data-set med peak stödnivåer hjälper med redovisning av fluktuationer i laser intensitet.
De högsta frekvenserna är en indikator på övergripande stryk frekvens; men komplicerade rörelse orsakar störningar på beat frekvenser i mönstret diffraktion och måste undersökas noggrant.
Denna metod kan användas för att undersöka förflyttningen av andra nematoder. Miljön kan ändras till ett annat medium. Våglängder kan ändras också. Arbeta i det synliga området av det elektromagnetiska spektrumet är enklaste och säkraste.
En mer förfinad modell kommer att simulera diffraktion spektra mer realistiskt i framtiden. En framtida modell kan omfatta en mask som kan ändra inriktning, som inte skulle påverka frekvens platser men relativa toppar. En mer realistisk modell skulle möjliggöra en probabilistisk fördelning av thrashing frekvenser, som skulle bredda topparna som i experimentella data. Ett uppslag i frekvenserna skulle hänsyn till variationer i thrashing frekvenser.
Den aktuella mask-formen är rå, särskilt i regionen huvud och svans, som bör vara mer avsmalnande än i den nuvarande modellen. Det kan vara intressant att genomföra en detaljerad analys av tidsserier med signalen eftersom det kan ge ledtrådar om komplexiteten i förflyttningen i olika mutanter.
Det är värt att överväga praktiskhet i expandera denna teknik till karaktärisera flera nematoder samtidigt. Denna metod bör förstås som en kompletterande metod för att befintliga metoder använder traditionella Mikroskop. Denna metod har en fördel i att inte kräva ett mikroskop under data-förvärvet så att masken kan flytta ut fokalplanet. I genomsnitt frekvens spektra visar tydliga skillnader i masken rörelse och kan kvantifieras genom förhärskande frekvens topparna, som är en ny metod kvantifiera mask locomotion. Dataanalys av diffraktion signaturerna är i vidareutveckling och kommer förhoppningsvis att leda till en automatiserad identifiering flera mutanter och individer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Juan Vasquez för hans computational bidrag med detta projekt. Vi är tacksamma för stödet från Vassar College grundutbildning forskning Summer Institute (URSI), Lucy Maynard lax forskningsfonden och NSF award nr 1058385.
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Fig. 4 |
Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |