Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио
Summary
Этот протокол представляет собой подход для анализа всей транскриптом от zebrafish эмбриона, личинки, или сортировка клеток. Мы включать изоляции РНК, путь анализа данных RNASeq и на основе ПЦР qRT Проверка изменения выражения гена.
Abstract
Анализ изменения выражения гена глобальных является ценным инструментом для выявления роман пути, лежащие в основе наблюдаемых фенотипов. Данио рерио является прекрасным примером для быстрой оценки всего транскриптом из всего животного или отдельных клеточных популяций из-за легкости изоляции RNA от большого количества животных. Здесь представлен протокол для анализа глобальных ген выражение в данио рерио эмбрионов, с помощью РНК последовательности (RNASeq). Мы описываем подготовка РНК из всей эмбрионов или клеточных популяций, полученные с помощью ячейку Сортировка в трансгенных животных. Мы также описать подход для анализа данных RNASeq для выявления обогащенного пути и онтология гена (GO) термины в наборах данных глобальной ген выражение. Наконец мы предоставляем протокол для проверки изменения выражения гена, с использованием количественных обратной транскриптазы ПЦР (qRT ПЦР). Эти протоколы может использоваться для сравнительного анализа, контроля и экспериментальных наборов данио рерио для определения изменения выражения гена Роман и обеспечить молекулярной понимание фенотипов интерес.
Introduction
Сравнительный анализ экспрессии генов глобальных является ценным инструментом для выявления роман гены способствуя наблюдаемых фенотипов. Такой анализ обычно полагаются на количественную оценку транскрипта изобилия по сравнению между экспериментальной и контроль образцов. Целевые подходы, такие как qRT ПЦР относительно быстрой и точной для исследования изменения выражения одного гена. РНК последовательности (RNASeq) предлагает широкий, гипотеза свободный подход к выявить значительные изменения в экспрессии генов между образцами, что делает его теперь стандарт для таких расследований экспериментальных систем.
Данио рерио стали известные модели во многих областях болезни. Первоначально разработанный для их полезности в биологии развития исследований, благодаря их высокой плодовитости и относительно низкая стоимость обслуживания, экспериментальное использование данио рерио развивалась включать широкий спектр фенотипов от эмбриональных взрослой стадии также как широкий спектр молекулярных assays1,2,3. Действительно эти преимущества делают механистический показывают быстрый и экономически эффективным из-за легкости приобретения большого количества материалов в сочетании с легкостью генетических и экологических манипуляций на всех этапах жизни. Кроме того прозрачный характер zebrafish эмбриона и личинки делают его идеальным для создания трансгенных репортер линии конкретных клеток и тканей, позволяя в vivo визуализации отдельных клеток населения4. Эксплуатация таких линий позволяет анализ выражения глобальной гена в типах конкретных изолированных клеток, основанные на выражении гена репортера.
Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для глобальных ген выражение анализа с использованием RNASeq после культуры zebrafish эмбриона. Генетические манипуляции экспериментальной, включая Морфолино (MO)-на основе переходных генов нокдаун или изменения генома ТРИФОСФАТЫ опосредованной, были представлены в другом месте5,6,7. Поэтому мы сосредоточиться на подробный протокол для изоляции RNA от всей эмбрионов или сортировка трансгенных репортер выражая клетки, следуют простой Вычислительный анализ RNASeq результаты, используя путь инструменты и генная Онтология (GO) термины. Наконец мы включили стратегию для проверки изменения выражения гена, количественная обратная транскриптаза ПЦР (qRT ПЦР). Эти протоколы применяются к данио рерио эмбрионов, подвергается широкий спектр экспериментальных условиях, включая сравнение генетических мутантов или экологических условий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подход, описанный в настоящем Протоколе предлагает сравнительно быстрое и экономически эффективные стратегии транскриптом уровень анализа всего животных или конкретных отсортированных клеточных популяций. Данио рерио обеспечивает модель выгодно для этот тип исследования из-за лег?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) и T32DK098107 (T.L.H. и J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
Referências
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
