Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı
Summary
Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.
Abstract
Küresel gen ifade değişiklikleri yeni yollar gözlenen fenotipleri temel tanımlamak için değerli bir araç analizidir. Zebra balığı yalıtım hayvanlar çok sayıda gelen RNA’ın bütün hayvan veya tek tek hücre popülasyonlarının kolaylığı nedeniyle gelen tüm transcriptome hızlı değerlendirilmesi için mükemmel bir modeldir. Burada küresel gen ifade analiz Zebra balığı embriyo RNA sıralama (RNASeq) kullanarak bir protokol sunulmuştur. Biz hazırlık RNA’ın bütün embriyo veya hücre içinde Transjenik hayvanlar sıralama kullanarak elde edilen hücre popülasyonlarının tanımlamak. Biz de zenginleştirilmiş yolları ve gen Ontoloji (GO) koşulları küresel gen ifade veri kümesi tanımlamak için RNASeq veri çözümlemesi için bir yaklaşımı açıklamak. Son olarak, nicel transkriptaz PCR (qRT-PCR) kullanarak gen ifade değişiklikleri doğrulamak için bir protokol sağlar. Bu protokollerin denetim karşılaştırmalı analizi ve deneysel Zebra balığı kümesi için roman gen ifade değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir ve moleküler fenotipleri ilgi içgörü sağlamak.
Introduction
Küresel gen ekspresyonu karşılaştırmalı analizi için gözlenen fenotipleri katkıda roman genlerin tanımlamak için değerli bir araçtır. Bu tür analizler genellikle nicel değerlendirmesi arasında deneysel karşılaştırıldığında transkript bereket itimat ve kontrol örnekleri. Hedeflenen yaklaşımlar, qRT-PCR gibi nispeten hızlı ve doğru tek gen ifade değişikliklerin incelenmesi için. RNA sıralama (RNASeq) gen ifade örnekleri, yapım o şimdi böyle araştırmalar için standart deneysel sistemleri arasında arasındaki önemli değişiklikleri tanımlamak için geniş, hipotez-Alerjik bir yaklaşım sunmaktadır.
Zebra balığı birçok hastalığı alanda genelinde önemli bir model olarak ortaya çıkmıştır. Başlangıçta gelişim biyolojisi çalışmaları, yüksek verimlilik ve bakım, nispeten düşük maliyeti nedeniyle onların yardımcı programı için geliştirilmiş Zebra balığı deneysel kullanımı fenotipleri gelen embriyonik olarak yetişkin aşamaları de için geniş bir eklemek gelmifltir bir 1,2,3dizi moleküler deneyleri. Nitekim, bu avantajları moleküler mekanik çalışmalar hızlı yapmak ve büyük miktarda malzeme edinme kolaylığı nedeniyle düşük maliyetli yaşam tüm aşamaları, genetik ve çevresel işleme kolaylığı ile kombine. Ayrıca, Zebra balığı embriyo ve larva şeffaf doğası vivo içinde görselleştirme ayrı hücre nüfus4sağlayan hücre ve doku özel transgenik muhabir satırları oluşturmak için ideal hale. Bu satırları sömürü küresel gen ifade analizi muhabir gen ifade üzerinde temel alan belirli izole hücre türlerine izin verir.
Burada RNASeq sonra Zebra balığı embriyo kültürü kullanarak küresel gen ifade analizi için kapsamlı bir iletişim kuralı mevcut. Morpholino (MO) dahil olmak üzere genetik deneysel manipülasyonlar-tabanlı geçici gen nakavt veya CRISPR-aracılı genom düzenleme, sunulmuş başka bir yerde5,6,7. Biz bu nedenle veya RNA izolasyonu bütün embriyolar için detaylı bir protokol odaklanmak transgenik muhabir ifade hücreleri RNASeq sonuçları yol araçları ve gen Ontoloji (GO) terimleri kullanarak basit hesaplamalı analiz tarafından takip sıralanmış. Son olarak, nicel ters transkriptaz PCR (qRT-PCR) tarafından gen ifade değişiklikleri doğrulama için bir strateji dahil ettik. Bu protokoller deneysel koşullar, genetik mutantlar veya çevre koşullarının karşılaştırılması dahil olmak üzere geniş bir tabi Zebra balığı embriyolar için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için açıklanan yaklaşım nispeten hızlı ve düşük maliyetli strateji bütün hayvanlar veya belirli sıralanmış hücre popülasyonlarının transcriptome düzeyi analizi için sunuyor. Zebra balığı avantajlı modeli çalışması bu tür için kolaylık ve malzeme, genetik uygulama kolaylığı veya çevre deneysel koşullar ve bir büyük kullanılabilirliğini başlayan büyük miktarda üreten içinde hız nedeniyle sağlar spektrum transgenik muhabir satır için hücre tipi özel ve doku öz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) ve T32DK098107 tarafından desteklenmiştir (T.L.H. ve J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
Referências
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
