Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk
Summary
Detta protokoll presenterar en strategi för hela transkriptom analys från zebrafisk embryon, larver, eller sorterade celler. Vi inkluderar isolering av RNA, väg analys av RNASeq data, och qRT-PCR-baserade validering av genförändringar uttryck.
Abstract
Analysen av globala genförändringar uttryck är ett värdefullt verktyg för att identifiera nya vägar bakomliggande observerade fenotyper. Zebrafiskar är en utmärkt modell för snabb bedömning av hela transkriptom från hela djur eller enskilda cellpopulationer på grund av lättheten av isolering av RNA från ett stort antal djur. Här presenteras ett protokoll för globala gen uttryck analys hos zebrafiskar embryon använder RNA-sekvensering (RNASeq). Vi beskriver beredning av RNA från hela embryon eller från cellpopulationer som erhållits med cellen sortera i transgena djur. Vi beskriver också en metod för analys av RNASeq data för att identifiera berikad vägar och Gene ontologi (gå) villkor i globala gen uttryck datamängder. Slutligen ger vi ett protokoll för validering av gen uttryck ändringar med hjälp av kvantitativ omvänt transkriptas PCR (qRT-PCR). Dessa protokoll kan användas för jämförande analys av kontroll och experimentella uppsättningar av zebrafisk för att identifiera gen uttryck ändringar och molekylär inblick fenotyper av intresse.
Introduction
Jämförande analys av globala genuttryck är ett värdefullt verktyg att identifiera nya gener bidrar till observerade fenotyper. Sådana analyser som normalt förlitar sig på kvantitativ bedömning av avskrift överflöd jämfört mellan experimentell och kontrollprover. Målinriktade strategier, såsom qRT-PCR är relativt snabb och noggrann utredning av enda gen uttryck förändringar. RNA-sekvensering (RNASeq) erbjuder en bred, hypotes-fri metod för att identifiera betydande förändringar i genuttryck mellan prover, gör det nu standard för sådana utredningar över experimentella system.
Zebrafisk har dykt upp som en framstående modell över många sjukdomsområden. Utvecklades ursprungligen för deras nytta i utvecklingsbiologi studier, på grund av deras hög fruktsamhet och relativt låga kostnader för underhåll, experimentell användning av zebrafisk har utvecklats till att omfatta ett brett spektrum av fenotyper från embryonala till vuxna stadier samt som en brett utbud av molekylära analyser1,2,3. Nämligen dessa fördelar gör molekylära mekanistiska studier snabba och kostnadseffektiva på grund av lättheten av förvärva stora mängder material kombinerat med användarvänlighet både genetiska och miljömässiga manipulation i alla skeden av livet. Dessutom öppet beskaffenhet zebrafiskar embryon och yngel gör den idealisk för radgenerering cell – och vävnadsspecifika transgena reporter att låta in-vivo visualisering av diskreta cell populationer4. Utnyttjande av sådana ledningar tillåter global gen uttryck analys i viss isolerad celltyper baserat på reporter genuttryck.
Här presenterar vi ett omfattande protokoll för globala gen uttryck analys med RNASeq efter kultur zebrafiskar embryon. Genetiska experimentella manipulationer, inklusive morpholino (MO)-baserade övergående gen knockdown eller CRISPR-medierad gen editering, har lagts fram någon annanstans5,6,7. Vi har därför fokusera på ett detaljerat protokoll för isolering av RNA från hela embryon eller sorterade transgena reporter-uttryckande celler följt av enkel computational analys av RNASeq resultat med väg verktyg och gen ontologi (gå) villkor. Slutligen har vi inkluderat en strategi för validering av genförändringar uttryck av kvantitativ omvänt transkriptas PCR (qRT-PCR). Dessa protokoll är tillämpliga på zebrafiskar embryon utsätts för en rad olika experimentella förhållanden, inklusive jämförelse av genetiska mutanter eller miljöförhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll erbjuder en relativt snabb och kostnadseffektiv strategi för transkriptom analys av hela djur eller specifik källsorterat cellpopulationer. Zebrafiskar ger ett fördelaktigt modell för denna typ av studie på grund av den lätthet och snabbhet i genererar stora mängder utgångsmaterial, lättheten att genomföra genetisk eller experimentella miljöförhållanden, och tillgången till en stor spektrum av transgena reporter rader möjliggör isolering av celltyp s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) och T32DK098107 (T.L.H. och J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
Referências
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
