Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur
Summary
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.
Abstract
Zelluläre Seneszenz ist eine Stress-Reaktion zeichnet sich durch ein stabiles Zellwachstum Verhaftung, die für viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Krebs und Altern wichtig ist. Vor kurzem hat Seneszenz auch in Gewebe-Reparatur und Regeneration verwickelt. Daher ist es immer entscheidend, alternde Zellen in Vivozu identifizieren geworden. Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay ist die am häufigsten verwendeten Assay, alternde Zellen in Kultur und in Vivozu erkennen. Dieser Assay basiert auf den erhöhten lysosomale Inhalt in den seneszenten Zellen, wodurch die histochemische Erkennung von lysosomalen β-Galaktosidase Aktivität bei bedenklich pH (6 oder 5,5). Im Vergleich zu anderen Tests, z. B. Durchflusszytometrie, dies erlaubt die Identifikation der alternde Zellen in ihrem Wohnsitz Umfeld, bietet wertvolle Informationen wie die Lage in Bezug auf die Gewebearchitektur, der Morphologie und der Möglichkeit der Kopplung mit anderen Markern über immunhistochemische (IHC). Die größte Beschränkung des SA-β-Gal-Assays ist die Anforderung von frischen oder gefrorenen Proben.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll um zu verstehen, wie zelluläre Seneszenz fördert zelluläre Plastizität und Tissue Regeneration in Vivo. Wir verwenden SA-β-Gal um zu erkennen seneszenten Zellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen, die ein etabliertes System, Geweberegeneration zu studieren ist. Darüber hinaus verwenden wir IHC Nanog, eine Markierung von pluripotenten Stammzellen in einem transgenen Mausmodell zu erkennen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, prüfen und zelluläre Seneszenz im Rahmen des induzierten zelluläre Plastizität und in Vivo Umprogrammierung zu quantifizieren.
Introduction
Zelluläre Seneszenz ist eine Form von Stress-Reaktion zeichnet sich durch eine stabile Zellzyklus Festnahme. In den letzten zehn Jahren hat Forschung etabliert, dass Seneszenz mit verschiedenen biologischen und pathologische Prozesse einschließlich der Embryonalentwicklung, Fibrose und Organismus Altern1,2verbunden ist. Zelluläre Seneszenz wurde zuerst in menschlichen Fibroblasten am Ende ihrer replikativen Lebensdauer ausgelöst durch Telomerverkürzung3gekennzeichnet. Neben replikativen Stress gibt es viele andere Reize, die Seneszenz, einschließlich DNA-Schäden, oxidativer Stress, onkogenen Signale und genomische/epigenomischen Veränderungen, die schließlich die p53/p21 und/oder pRB Wege zum aktivieren kann auslösen können Aufbau und die Konsolidierung der permanenten Wachstums Verhaftung1. Eines der wichtigen Merkmale der alternde Zellen ist, dass sie metabolisch aktiv bleiben und kräftig einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP ausdrücken): Sekretion von inflammatorischen Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrix Faktoren-4. SASP Faktoren sind vorgeschlagen worden, um eine wichtige Rolle bei der Vermittlung und Verstärkung des Seneszenz Effekts aufgrund ihrer potenten Wirkung auf Immunzellen zieht und lokale und systemische Gewebe Milieus1zu verändern. Interessanterweise hat Seneszenz vor kurzem vorgeschlagen worden, für Gewebe Reparatur und Regeneration5,6wichtig sein. Darüber hinaus hat die Daten aus mehreren Labors, einschließlich der unsrigen, vorgeschlagen, dass Gewebe Schaden-Induzierte Seneszenz zellulärer Plastizität, über SASPs, Förderung der Regeneration7–9verbessern könnte. Daher, die entstehenden Daten unterstreichen die Bedeutung des Studiums Seneszenz in Vivo.
In der Post-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Ära ist zelluläre Plastizität die Fähigkeit einer Zelle, eine neue Identität zu erwerben und eine alternative Schicksal wenn verschiedene Reize in Kultur und in Vivo10ausgesetzt zu verabschieden. Es ist bekannt, dass vollständige Neuprogrammierung kann erreicht in Vivo11,12, wo der Ausdruck der der Kassette mit vier Yamanaka Faktoren: Oct4, Sox2, Klf4und c-Myc (OSKM) kann induzierte in Vivo , darum Bildung in mehreren Organen zu fördern werden. Daher ein programmierbar Mausmodell (i4F) als ein leistungsfähiges System lässt sich identifizieren wichtige Regulatoren und Signalwege, die für die zelluläre Plastizität11wichtig sind.
Eine geeignete und sensibel in Vivo -System ist wichtig zu verstehen, wie zelluläre Seneszenz reguliert zelluläre Plastizität im Zusammenhang mit der Geweberegeneration. Hier präsentieren wir Ihnen ein robustes System und ein detailliertes Protokoll, das Bindeglied zwischen Seneszenz und zelluläre Plastizität im Zusammenhang mit der Geweberegeneration zu bewerten. Die Kombination von Cardiotoxin (CTX) induzierte Schädigung der Muskulatur in den m. Tibialis Anterior (TA) Muskel-Gruppe, ein etabliertes System, Geweberegeneration und i4F Mausmodell zu studieren ermöglicht die Erkennung von zellulären Seneszenz und in vivo Umprogrammierung während der Muskelregeneration.
Um die Verbindung zwischen zelluläre Plastizität und Seneszenz zu bewerten, i4F Mäuse mit CTX induzieren akute Muskelschäden verletzt und behandelt mit Doxycyclin (0,2 mg/mL) innerhalb von 7 Tagen, in Vivo Umprogrammierung zu induzieren. Während eine CTX akuten Muskelschäden induzierten und Regeneration Protokoll kürzlich veröffentlichten13, aus ethischen Gründen wurde, wird dieses Verfahren in das aktuelle Protokoll weggelassen werden. TA-Muskel-Proben werden bei 10 Tagen Post Verletzungen13, erhoben, wenn der Höhepunkt der alternde Zellen wurden bisher14beobachtet. Dieses ausführliche Protokoll beschreibt hier, alle erforderlichen Schritte, um die Ebene der Seneszenz (über SA-β-Gal) und Neuprogrammierung (über IHC beflecken von Nanog) zu bewerten.
Seneszenz-assoziierten Beta-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay ist die am häufigsten verwendeten Assay, beide seneszenten Zellen in Kultur und in Vivo15zu erkennen. Im Vergleich zu anderen Tests, ermöglicht der SA-β-Gal-Test die Identifikation der alternde Zellen in ihrer natürlichen Umgebung mit intaktem Gewebearchitektur, die besonders wichtig für in-Vivo -Studie ist. Darüber hinaus ist es möglich, die SA-β-Gal-Assay mit anderen Markern mit IHC zu koppeln. Allerdings erfordert der SA-β-Gal-Assay frische oder gefrorene Proben, bleibt eine große Einschränkung. Wenn frisches oder gefrorenes Gewebe wie gefrorene TA Muskel Proben routinemäßig verfügbar sind, ist SA-β-Gal offensichtlich die am besten geeigneten Assay seneszenten Zellen zu erkennen. NANOG ist der Marker verwendet, um neuprogrammiert Zellen aus zwei Gründen: 1) Es ist eine wesentliche Marker für Pluripotenz; (2) Darüber hinaus seinen Ausdruck wird nicht durch Doxycyclin (Dox) angetrieben, deshalb erkennt es induzierten Pluripotenz anstatt der erzwungenen Ausdruck der Yamanaka-Kassette.
Es ist wichtig zu beachten, die Färbung Protokolle präsentiert in dieser Studie können separat durchgeführt werden, um die Quantifizierung Verfahren zu vereinfachen, sondern können auch in eine Co Färbeverfahren, beide seneszenten zu visualisieren und pluripotente Stammzellen im selben Abschnitt durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine Methode, um beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur programmierbar Mäuse. Diese Methode kann verwendet werden, bewerten beide Seneszenz zu quantifizieren und induzieren zelluläre Plastizität in Vivound untersuchen die Rolle der Seneszenz in Gewebe-Reparatur und Regeneration.
In dem aktuellen Protokoll dient der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay in Vivo seneszenten Zellen in der Skelettm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind verpflichtet, Clemire Cimper für ihre ausgezeichneten technischen Support. Arbeit im Labor von H.L wurde finanziert vom Institut Pasteur, Centre National Pour la Recherche Scientific, und die Agence Nationale De La Recherche (Laboratoire d ‘ Excellence Revive, Investissement Avenir; ANR-10-LABX-73), die Agence Nationale De La Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) und Fondation ARC (PJA 20161205028). C.c. und A.C. finanziert die Promotion und Postdoc-Stipendien aus dem Konsortium wieder zu beleben.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
Referências
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
